基于环状RNA脊柱结核早期诊断分子标记物的筛选和鉴定

来源 :昆明医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:liweimin90
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[目的]骨结核是最常见的肺外结核,而脊柱结核是最常见的骨与关节结核,约占骨结核的50%左右。脊柱结核主要依据临床表现、影像征象及相关实验室检查做出诊断,但其早期临床表现、影像表现及相关实验室检查均缺乏特异性,使得脊柱结核的早期诊断比较困难。环状RNA和微小RNA是近年发现的一类重要的ceRNAs,在基因表达调控中发挥重要作用,具有发掘为早期诊断分子标记物的极大潜能。在结核病中微小RNA已有相关的研究和报道,但目前仍无针对结核病中环状RNA的相关研究。本实验对脊柱结核患者外周血中差异性表达的环状RNA进行筛查和鉴定,初步探讨其作为脊柱结核早期诊断分子标记物的效力和其参与脊柱结核病理可能的作用机制。[材料和方法]本研究内容主要包括以下部分:1.脊柱结核患者外周血中环状RNA差异表达谱的筛查:使用Human circular RNAArray 8×15K芯片分别对脊柱结核病例组(n=4)及空白对照组(n=3)进行检测,依据倍数变化(fold change,FC≥2倍)且P值(P<0.05),筛选出差异表达的环状RNAs。由于符合此条件的差异表达基因数量较大,再通过调节FC进一步筛选出FC≥10或FC≤-5倍且P<0.05的环状RNA进行统计描述。2.基因芯片的扩大样本量验证:由于本实验中基因芯片数量较小,其结果可能有假阳性和不稳定性,我们从中随机抽取5个环状RNA,采用real-time PCR技术对其在32个独立样品(病例组n=20;对照组n=12)中进行扩大样本量验证。3.环状RNA400005对脊柱结核的早期诊断效率的评估:采用real-time PCR技术对环状RNA400005在32个独立样品(病例组n=20;对照组n=12)中的表达量进行检测,将检测结果转化为两分类(即是、否有差异表达量)和脊柱结核患者或健康对照之间进行特异性、敏感性的检测,同时通过建立受试者操作特征曲线(ROC曲线),利用曲线下面积指标(AUC)评价其对脊柱结核的诊断效率。4.将环状RNA表达谱和微小RNA表达谱进行联合分析,初步探讨环状RNA参与脊柱结核病理过程中可能的作用机制:由于环状RNA可作为微小RNA海绵发挥生物学功能,本实验将同一批临床样本不同的检测内容(即差异表达环状RNAs和微小RNAs)通过具有相同微小RNA应答元件(miRNA response element,MRE)特性进行联合分析,再通过 Miranda、MirBase和TargetScan数据库对目标微小RNA进行靶基因预测,并进行GO、Pathway和Network等生物信息学分析。探讨环状RNA400005可能通过干预miR-19a-3p及其靶基因的表达在脊柱结核中发挥其生物学作用。[结果]1.环状RNA差异表达谱筛查的结果:所有样品的质量检测结果均合格。初步筛选出1020个差异表达的circRNA(表达增高的有486个,表达降低的有534个)。进一步筛选出来的有70个(表达升高的31个,表达降低的39个)在论文中进行展示。2.基因芯片的扩大样本量验证的结果:circRNA400005在病例组表达增高(P<0.05),其结果与芯片检测结果基本一致。3.circRNA400005对脊柱结核的早期诊断效率的评估结果:检测出circRNA400005对脊柱结核早期诊断的敏感性为89.4%,特异性为61.5%。通过绘制ROC曲线,评估circRNA400005对脊柱结核患者的诊断效率,其AUC=78.1%(p<0.05)。4.环状RNA表达谱和微小RNA表达谱进行联合分析的结果:①circRNA400005与miR-19a-3p 之间存在负相关关系(spearman’s rho=0.824,p<0.05),说明了circRNA400005通过MRE调控miR-19a-3p的表达。②通过三个数据库的预测,发现TNF为miR-19a-3p的靶基因之一;在network分析中miR-19a-3p处于中心位置。而靶基因功能GO分析主要涉及MAKP激酶活性、细胞代谢调节和巨噬细胞化学趋化等;同时,通过pathway分析其靶基因功能主要涉及MAKP、TNF和Rap1等信号通路。[结论]1.脊柱结核患者外周血中存在大量差异表达的环状RNA和miRNA表明,由于环状RNA比miRNA具有更好的稳定性,它也具有成为脊柱结核早期诊断分子标记物的巨大潜能。2.环状RNA(circRNA 400005)判断脊柱结核患者的敏感性和特异性均为中度,结果说明脊柱结核是涉及多基因、多层次基因表达和调控形成的复杂网络,单一的分子标记物的诊断效率并非十分理想。3.环状RNA(circRNA400005)可能通过调节微小RNA(miR-19a-3p)及其靶基因的表达而发挥其在脊柱结核中的生物学作用,即它可能通过参与MAKP、TNF和Rap1等信号通路、调控其靶基因TNF的表达在脊柱结核的病理过程中发挥作用。但该结论仍有待进一步的实验验证。
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