茶叶中EGCG、ECG和GCG对B16F10细胞内黑色素生成的影响及机理研究

来源 :湖南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:sticker2009
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对于女性来说,健康白皙是最理想的肌肤状态,而皮肤黑色素的含量及分布在很大程度上影响着肌肤的呈色。皮肤黑色素主要是产生于表皮基底层的黑色素细胞,黑色素细胞内酪氨酸酶的活性在皮肤受到紫外线照射后会被激活,增加黑色素的生成量,皮肤颜色加深变暗。随着化妆品行业的发展与成熟,消费者对美白产品的要求也不断提高,天然植物提取物因具有良好的美白效果且安全性好,成为医药学和化妆品行业研究的热点。茶叶含有广泛的生物活性成分,是具有保健功能和预防人体疾病的健康饮品。目前关于茶叶提取物美白功效的研究,大多集中于对体外酪氨酸酶活性的抑制作用,而以体外培养的黑色素细胞为对象,研究茶叶提取物对黑色素生成的影响还鲜有报道。国内对茶黄素(Theaflavins,TFs)和表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)抑制黑色素生成进行了少量研究,而国外也只研究了表儿茶素没食子酸酯(Epicatechin gallate,ECG)和没食子儿茶素没食子酸酯(Gallocatechin gallate,GCG)对体外蘑菇酪氨酸酶活性的抑制作用。本论文基于α-MSH信号通路,以B16F10黑色素瘤细胞作为受试细胞,研究了茶儿茶素EGCG、ECG、GCG对黑色素生成的影响及机理。本文主要研究结果如下:1.EGCG、ECG、GCG抑制B16F10细胞内黑色素的生成分别用不同浓度的EGCG、ECG、GCG和熊果苷处理B16F10黑色素瘤细胞,采用倒置显微镜观察茶儿茶素对细胞形态的影响,以溴化二苯四偶氮法(MTT法)测定B16F10细胞的增殖率,以左旋多巴(L-DOPA)为底物测定细胞内酪氨酸酶的活性,采用氢氧化钠裂解法测定细胞内黑色素的含量。试验结果表明,EGCG、ECG和GCG对B16F10细胞形态的影响表现为随浓度的增加细胞数目逐渐减少,对细胞生长有明显抑制作用。EGCG、ECG、GCG对B16F10细胞的增殖、酪氨酸酶活性以及黑色素生成量均有抑制作用(p<0.05),抑制作用随浓度的升高而增强,且ECG效果最优,EGCG次之并优于GCG,三者的作用效果均优于熊果苷(Arbutin,AR)。2.EGCG、ECG、GCG下调黑色素生成相关基因的表达采用实时荧光定量PCR检测细胞内小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor,MITF)基因、酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)基因、酪氨酸相关蛋白1(Tyrosinase related protein 1,TRP-1)基因以及酪氨酸相关蛋白2(Tyrosinase related protein 2,TRP-2)基因的相对表达量。试验结果表明,相对于对照组,EGCG、ECG、GCG均下调MITF、TYR、TRP-1、TRP-2的表达,对MITF基因表达的下调作用最明显(p<0.01)。EGCG浓度为60μg·mL-1时,B16F10细胞中MITF基因表达量与对照组相比下调了70%,而ECG则对TYR基因表达的下调作用最为明显(p<0.01)。3.EGCG、ECG、GCG降低B16F10细胞内cAMP水平并下调黑色素生成相关蛋白的表达运用环磷酸腺苷(cyclic Adenosine monophosphate,cAMP)E-lisa试剂盒对B16F10细胞内cAMP水平进行检测,用Western blot技术检测EGCG、ECG、GCG和熊果苷对B16F10细胞中环磷腺苷效应元件结合蛋白1(cAMP-response element binding protein1,CREB1)、磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白1(phospho-cAMP-response element binding protein 1,p-CREB1)、小眼畸形相关转录因子、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1、酪氨酸酶相关蛋白2相对表达量的影响。试验结果表明,EGCG、ECG和GCG明显降低B16F10细胞内cAMP水平(p<0.01);相对于对照组,EGCG、ECG和GCG均下调CREB1、p-CREB1、MITF、TYR、TRP-1、TRP-2蛋白的表达,具有极显著差异(p<0.01)。
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