黄瓜转酮醇酶基因的克隆及功能分析

来源 :山东农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:a369747001
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
转酮醇酶(Transketolase,TK)是一种焦磷酸硫胺素依赖性酶,参与高等植物的卡尔文循环,在很大程度上控制着光合碳固定和RuBP再生。为了探明TK对光合作用的调控机理,本文以‘津优3号’黄瓜(Cucumis sativaL.)为试材,克隆TK基因,分析其基因表达特性;构建正、反义表达载体,通过农杆菌介导法转化黄瓜,系统分析其基因功能和转基因植株在日光温室中的应用潜力。主要结果如下:  1.利用同源序列设计简并引物,通过RT-PCR法从黄瓜叶片克隆到TK基因的中间片段,大小为526 bp,通过Race法获得该基因全长,大小为2368 bp,ORF为2229 bp,编码742个氨基酸,分子量为80.62 kDa,在Genbank上登录号为JF972598,命名为CsTK。  2.氨基酸同源序列比较发现,黄瓜的TK氨基酸序列与玉米、烟草、马铃薯、侧茎头菊和拟南芥的TK氨基酸序列同源性分别为87%、92%、93%、83%和89%。在TK氨基酸的N-末端有一段富含丝氨酸的氨基酸序列,可以识别叶绿体,保证TK顺利进入叶绿体。  3.构建了原核表达体pET-CsTK,并在大肠杆菌BL21(DE3) plysS中诱导表达。以重组蛋白免疫Ba1b/c雌性小白鼠,制备抗体,效价为1∶500,可以检测CsTK在蛋白水平上的表达。  4.Real-time PCR和Western杂交结果显示,TK在黄瓜叶、茎、果实和根中均有表达,其中叶片中表达量最高;在不同叶位中以上数第4片展开叶表达量最高,显著高于顶部叶和基部叶的表达量,中位叶的活性也显著高于顶部叶和基部叶;晴天条件下,黄瓜功能叶片的TK基因表达量和活性日变化与Pn的日变化趋势一致,呈单峰曲线型,其高峰出现在14:00,说明TK参与黄瓜叶片Pn日变化。  5.TK基因受高温强光(40℃/1600μmol·m-2·s-1)和低温弱光(5℃/100μmol·m-2·s-1)诱导,说明TK与黄瓜对短时温光胁迫的防御机制有关;低温弱光胁迫时间超过24 h时,其基因表达量和酶活性趋于下降,可见,TK对高温强光的忍受能力要高于其对低温弱光的忍受能力,长时间低温弱光导致黄瓜TK活性和基因表达量下降是引起其Pn降低的重要原因之一。  6.将获得的TK基因全长与含有35 S的pBI121载体重组,分别构建了正、反义表达载体,通过农杆菌介导法转化黄瓜子叶节,用Real-time PCR和Western杂交法对具有卡那抗性的转基因黄瓜植株检测,结果显示,转正义植株中的CsTK过量表达,而转反义植株中表达量显著下降。  7.正义转基因黄瓜种子饱满,发芽率与野生型的差异不显著;而反义株系的种子干瘪,发芽率低。CsTK过量表达可使黄瓜叶片的TK活性、Pn及卡尔文循环其他酶活性与mRNA表达量显著升高,碳水化合物积累量增多,初花期提前2d,雌花比例显著提高,前期产量明显增加;CsTK沉默时,结果相反。  8.低温弱光胁迫6h时,黄瓜叶片的Pn显著降低,电解质渗漏率(EL)明显升高。转正义黄瓜植株的Pn的降低程度和EL升高程度显著低于野生型的;而转反义植株的Pn和ψPSⅡ降低幅度和电解质渗漏率的升高幅度显著高于野生型的。可见,CsTK的过量表达可以提高黄瓜植株的低温弱光耐性,而基因沉默,结果相反。
其他文献
We numerically study the effect of the channel noise on the spiking synchronization of a scale-free Hodgkin–Huxley neuron network with time delays. It is found
初中道德与法治教学渗透扶贫理念教育,就是要引导学生逐步培养良好的道德情操和刚毅的品格,启发学生热爱人民、热爱社会主义祖国、具有创新精神和社会责任感.
该试验以目前生产上的主栽品种新红星和红富士苹果为试材,通过田间试验、室内显微观察和内含物分析,研究了外源多胺对苹果坐果率、授粉受精、营养物质含量、内源激素含量和
由上海社会科学院世界经济研究所和中国世界经济研究所共同主编的《世界经济导报》,是一九八○年六月,由几位老新闻工作者在上海创办的。当《世界经济导报》刚问世时,并没有
该文详细报告了作者对芜菁自交不亲和性若干遗传特性的遗传研究结果.