目的脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)是世界性医学难题之一,其治疗策略一直未能取得突破性进展,究其原因是脊柱脊髓损伤病理生理机制的研究尚不明确。研究表明与中枢神经系统不同,周围神经系统损伤后的神经元能够维持其再生能力,并且能够在允许的生长环境中促进神经元生长锥的形成,影响轴突生长,这与神经损伤后DNA甲基化明显改变有关。神经损伤可引起启动子区大量的DNA甲基化或去甲基化改变,介导损伤反应中的轴突再生、神经胶质细胞活化、血管再生等。因此揭示中枢和外周神经损伤后DNA甲基化修饰调控神经再生的机制至关重要,有望为SCI后神经修复这一医学难题提供新的理论基础及治疗靶点。方法1.建立实验动物损伤模型:本研究共使用36只Wistar大鼠,分为4组。第1组:坐骨神经暴露组(n=9);第2组:坐骨神经损伤组(n=9);第3组:椎板切除组(n=9);第4组:脊髓损伤组(n=9)。第1组的大鼠接受坐骨神经暴露手术;对于第2组的大鼠,双侧坐骨神经被暴露并在坐骨神经的近端用丝线结扎;第3组大鼠在没有脊髓损伤的情况下进行椎板切除术;第4组T10-11节段椎板切除术后,并在T10-11节段将包括脊柱神经根在内的2mm的脊髓组织段完全切除。2.应用高通量测序技术建立DNA甲基化差异性基因数据库:分离坐骨神经暴露组与坐骨神经损伤组双侧坐骨神经,提取激活态雪旺细胞(ASCs)和正常态雪旺细胞(NSCs)培养至第三代,收集用于Me DIP-seq。处死上述椎板切除组和脊髓损伤组的所有大鼠,收集脊髓组织用于WGBS,建立外周神经与脊髓损伤后DNA甲基化差异性基因数据库。3.生物信息学分析揭示周围神经系统与脊髓损伤后轴突再生相关基因DNA甲基化的改变:利用生物信息学方法对筛选出的差异表达基因进行功能注释(GO)、信号通路(KEGG)分析及蛋白质互作网络分析(PPI),q RT-PCR进一步验证生物信息学分析的结果。结果1.应用Me DIP-seq检测外周神经损伤后DNA甲基化基因改变:本研究分离培养ASCs和NSCs,免疫荧光S-100染色,两者均是阳性结果。Me DIP-Seq结果显示177176区域存在甲基化差异,其中221个与轴突再生相关的差异甲基化基因,主要参与轴突形成、轴突生长、轴突导向等过程。2.应用WGBS揭示脊髓损伤后DNA甲基化的改变:脊髓损伤后,观察到大量空洞、坏死组织区及大量炎性细胞。全基因组重亚硫酸氢盐测序共发现235个差异DNA甲基化基因,其中96个基因差异性显著(P<0.001),50个为高甲基化基因,46个为低甲基化基因,主要富集在河马信号通路、内吞作用通路,、钙信号通路等信号传导途径。3.DNA甲基化关键差异基因的筛选与分析:本研究对比上述两数据库,共筛选出8个轴突再生相关的DNA甲基化差异基因,为Ntrk3、Reln、Tenm2、Numbl、Dpysl2、Smurf1、Lmx1a、Kalrn。GO分析显示其在生物进程主要参与神经元再生、信号转导、神经系统发育等,在分子功能主要富集于信号受体结合、蛋白质结合、金属离子结合等,在细胞组分主要集中于细胞质、质膜等。KEGG富集分析结果表明,差异甲基化基因主要富集于钙信号通路、Endocytosis信号通路、河马信号通路等。结论本研究应用生物信息学来识别神经系统损伤后不同甲基化基因,揭示了脊髓损伤和坐骨神经损伤后DNA甲基化基因的重塑,发现8个轴突再生相关的基因差异性,为Ntrk3、Reln、Tenm2、Numbl、Dpysl2、Smurf1、Lmx1a、Kalrn,其中Dpysl2促进神经元的引导、生长及微管组装,介导生长锥塌陷,并且与钙通道有密切联系。这些常见的中枢和周围神经损伤后表观遗传变化的基因被认为是神经再生和建模的候选靶点或生物标志物。本研究为亚急性期神经损伤轴突再生的分子机制提供新的见解,然而仍需要进一步的研究来验证这些表观遗传变化之间的功能和关系。