奶牛乳房炎是由物理、化学或微生物等因素刺激奶牛乳腺所引发的一种炎症反应,其中多种病原微生物的感染是引起奶牛乳房炎的主要病因。该病广泛存在于世界各地,其发生率至今仍相当高。它不仅仅给世界奶牛养殖业带来了巨大的经济损失,也给乳品工业的发展、公共卫生以及食品安全带来一定隐患。本研究以上海地区规模化奶牛场乳房炎患牛为实验对象,分离鉴定出引起奶牛乳房炎的主要病原菌,对这些主要病原菌进行基因分型和耐药性分析,并探索重组溶菌酶质粒防治奶牛乳房炎的疗效及其对环境的安全性;旨在获得上海地区奶牛乳房炎病原菌及其药物敏感性的系统资料,为指导临床合理用药和提高奶牛乳房炎防治效果提供理论依据,也为系统开展奶牛乳房炎致病菌的分子流行病学调查、血清学分型和耐药性研究奠定基础。主要研究包括以下四个内容:(1)上海地区奶牛乳房炎主要病原菌的分离鉴定。本实验对从上海郊区四个奶牛场采集的临床型和隐性乳房炎患牛的126份奶样进行细菌培养、分离鉴定,共分离到主要病原菌107株,其中金黄色葡萄球菌74株,占分离菌株的69.16%;无乳链球菌27株,占分离菌株的25.23%;病原菌单独感染率为48.78%,其中金黄色葡萄球菌的单独感染率达39.02%;病原菌混合感染率占51.22%,多为金黄色葡萄球菌和无乳链球菌混合感染。(2)引起奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的基因分型。本实验采用ERIC-PCR分型方法,对分离所得的74株金黄色葡萄球菌进行了基因分型。结果显示,74株金黄色葡萄球菌可扩增出4~9条带,共分为4个聚类群,亲缘关系相同或相近的菌株占79.7%。发现在同一牛群中的分离株可以存在相同的基因型,也可以存在不同的基因型;而不同牛群中的分离株也可属于同一基因型。这种结果提示,上海地区引起奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌多为同一基因型,在某个或某些牛群中存在A类一金黄色葡萄球菌的优势流行株。但不同环境和条件下同一种病原菌的基因型也存在一定差异,可能存在多个金黄色葡萄球菌的流行株。(3)上海地区奶牛乳房炎主要病原菌的耐药性分析。本实验根据NCLS标准,对分离所得的107株主要病原菌运用琼脂扩散法进行药敏试验。结果显示,主要病原菌对头孢拉定、环丙沙星、庆大霉素敏感,其中对头孢拉定的敏感性接近100%;对大多数抗菌素产生了不同程度的耐药性,对氨苄青霉素产生了完全耐药性。(4)治疗奶牛乳房炎的基因药物(pcDNAKLYZ)在上海地区的疗效及环境释放试验。为验证该基因药物在大规模推广使用前的疗效和对环境的安全性,按照农业部颁布的《农业转基因生物安全评价管理办法》要求,选择地处相对偏僻的某奶牛场为试验地,用人溶菌酶重组质粒pcDNAKLYZ分别治疗干乳期和泌乳期患牛。初步试验结果显示,干乳期患牛的治愈率为90.91%,泌乳期患牛治疗的有效率为82.4%;奶样中细菌总数和主要病原菌的检出率都明显降低,而且随着治疗后时间的推移呈逐渐下降趋势。随后对实验牛的血液、乳汁进行质粒残留检测,并对唾液、尿液、粪便和饲养环境中的微生物进行转化菌检测。结果显示,仅70.1 %(5/7)的泌乳牛在治疗后的1 d从奶中检测到质粒,而血液检测结果始终为阴性;也未发现该重组质粒被分泌、排泄物中菌群以及环境中微生物的摄取、转化。因此,该重组质粒对奶牛乳房炎具有较好的预防和治疗效果,且对环境是安全的。