研究背景:外周神经损伤是常见的外伤,各种创伤所导致的外周神经损伤发生率约为1.3-2.8%[1,2],尽管神经损伤后,神经在一定程度上能通过再生、重建达到功能的恢复。在外周神经损伤后,神经轴突出现断裂变性、神经传导中断、脱髓鞘病变等,并伴随神经内水肿,损害的远端出现瓦勒氏变性等一系列的病理性改变[3]。神经损伤给患者带来了巨大的痛苦和经济负担。雷帕霉素是经美国食品与药品管理局批准可用作免疫抑制剂的一种真菌化合物,能够通过抑制mTOR1细胞信号通道蛋白增强自噬功能。雷帕霉素激活自噬功能在许多神经系统性疾病中发挥着神经保护作用[4,5]。近年来,雷帕霉素被广泛应用于神经系统疾病研究[6-9]。其在颅脑创伤模型研究表明,mTOR的抑制剂雷帕霉素能够增强自噬,减轻中枢神经系统炎症反应,促进中枢神经系统功能恢复。雷帕霉素应用在亨廷顿、帕金森等神经退行性疾病中发现其能增强自噬功能,保护神经细胞。自噬作为真核生物普遍存在的现象,其通过溶酶体途径降解细胞质成分,主要功能是清除细胞内异常的蛋白质和受损的细胞器,在细胞重建中起到重要作用,是近年来生命科学研究领域的热点之一[10-12]。研究表明,自噬与多种疾病的生理病理过程密切相关,包括:感染,肿瘤,神经退行性病变,创伤等。其中,自噬功能障碍是肿瘤的发生发展和神经退行性病变的重要原因。在神经损伤模型(包括:颅脑损伤、脊髓损伤)研究表明,自噬能够减轻氧化应激,在损伤、疾病等条件下,为细胞提供必要能量,维持细胞的存活。外周神经纤维主要由胶质细胞和中枢神经元发出的树突、轴突构成。外周神经系统(PNS)和中枢神经系统(CNS)共同组成机体统一的神经系统,二者存在许多共通之处[13]。中枢神经系统的少突胶质和外周神经系统的施旺细胞包裹神经元轴突构成髓鞘,调控有髓纤维快速神经传导。其中,中枢系统疾病和外周神经病变直接导致神经损伤神经树突、轴突丢失,神经联系破坏。目前,自噬在外周神经神经系统的调控作用尚未明确。自噬在外周神经损伤应激条件下也可能起到神经保护作用,从而促进神经的再生修复和功能的恢复。实验目的:应用手术损伤建立各种动物模型是相关研究的主要途径。本研究应用外周神经(坐骨神经)损伤模型,通过雷帕霉素抑制mTOR信号通路控制自噬水平,研究以下3个方面内容:(1)外周神经损伤后,不同阶段神经修复情况与机体自噬水平的变化情况的关系;(2)外周神经损伤后,不同阶段神经运动功能恢复情况与机体自噬水平的变化情况的关系;(3)外周神经损伤后,施旺细胞存活情况与机体自噬水平变化情况的关系。实验方法:1.实验动物模型的建立:所使用动物均购于南方医科大学动物实验中心。动物实验规程均在南方医科大学伦理委员会认可下进行。予模型动物腹腔注射10%水合氯醛(50mg/kg)麻醉后,切开股骨中段皮肤,暴露坐骨神经,用组织钳夹紧坐骨神经中段10秒3次,每次间隔10秒,外周神经损伤模型建立后,缝合皮肤。所有操作均在无菌条件下进行。2.实验分组与给药:将60只雌性SD大鼠随机分为4组:假手术组:切开皮肤暴露外周神经(坐骨神经),缝合伤口后,予等剂量生理盐水腹腔注射;手术对照组:切开皮肤,暴露外周神经(坐骨神经)并进行造模,术后予等剂量生理盐水腹腔注射;自噬激活组:切开皮肤,暴露外周神经(坐骨神经)并进行造模,术后予1mg/kg雷帕霉素腹腔注射。自噬抑制组:切开皮肤,暴露外周神经(坐骨神经)并进行造模,术后予50mg/kg3-Methyladenine自噬抑制剂腹腔注射。术后每日给药,共7天。3.实验指标检测:(1)Catwalk步态行为学分析:分别于术后1周、2周、3周、6周,使用Catwalk步态分析仪对运动中的大鼠进行步态分析。光线从荧光管中发出,透过玻璃平板。当大鼠的脚掌与玻璃平板的表面接触时,光线向下反射,使得下方的高速摄像头捕捉到清晰的脚印图像,通过CatWalk步态分析仪全程录制大鼠的脚印。在模型制作前,将大鼠置于Catwalk步态分析仪中训练2周,使大鼠在实验时能以恒速无停顿地通过Catwalk步态分析仪通道。(2)Western blot蛋白印迹检测(自噬相关蛋白:LC-3Ⅱ;神经修复相关蛋白:MBP、NF-200):各个时间点随机取各组3只样本,予10%水合氯醛腹腔麻醉后,处死,取伤段坐骨神经,加入组织裂解液匀浆,离心,取上清液,测浓度,备用。用10%(v/v)SDS-PAGE电泳分离蛋白样品(每孔上样20μg)后,转到PVDF膜上,再依照Marker切取相应的蛋白条带。上述含有相应蛋白条带的PVDF膜经3%牛血清白蛋白(w/v)封闭1小时后,再用将羊抗人多克隆抗体(1:1 000稀释)在4℃条件下孵育PVDF膜过夜。二抗使用偶联过氧化物酶HRP的山羊抗兔IgG(1:5 000稀释)室温孵育2小时,最后蛋白条带用增强化学发光底物检测试剂盒检测后,于暗室中压上X光片,曝光后显影、定影。应用Image J软件分析定量,分析相应蛋白表达水平。(3)免疫组织化学:各组大鼠于造模后1周和6周,予0.3ml/100g 10%水合氯醛麻醉后暴露心脏,经左心室插管至升主动脉,剪开右心耳,快速灌注PBS 250mL,随后灌注4%多聚甲醛液500ml(0.1moL/L,PH7.4)固定。取各组大鼠损伤节段神经,行脱水、透明、石蜡包埋、制成厚度为2μm的连续石蜡切片,脱蜡至水后,在3%的H,O,溶液中封闭内源性过氧化物酶20分钟,pH 6.0的枸橼酸钠缓冲液中、高火高压抗原修复10分钟,加入一抗37℃下孵育60分钟,二抗37℃下孵育30分钟,二氨基联苯胺(DAB)显色后行苏木素复染、脱水、透明、及封片,显微镜下观察并分别在100X和200X倍镜下进行拍照,进行统计学分析。(4)电镜:分别在造模后1周和6周处死各组大鼠,取损伤神经段组织块投入3.7%戊二醛磷酸缓冲溶液固定,磷酸缓冲液反复冲洗,1%锇酸后固定1小时,丙酮系列脱水,饱和醋酸铀染色,环氧树脂包埋,超薄切片,枸橼酸铅染色,日本东京JEM-1010透射电镜下观察坐骨神经超微结构变化。(5)TUNEL凋亡细胞检测:坐骨神经损伤后1周,伤段坐骨神经凋亡细胞检测根据碧云天凋亡试剂盒说明书进行操作。4.统计学处理:所有数据均用均数±标准误(Mean±S.E.M)表示,用SPSS16.0分析软件进行统计处理。组内比较使用单因素方差分析(ANOVA),组间比较使用单因素方差分析(ANOVA),如果差异存在显著性差异,则使用Bonferroni校正法进行组间两两分析。以P<0.05为检验水准,认为存在显著性差异,用Graphpad prism 5软件进行绘制图表。实验结果:(1)外周神经早期损伤后,自噬水平通过给予雷帕霉素激活,而通过给予3-甲基腺嘌呤受到抑制;在外周神经损伤1周后,在电镜下观察伤段坐骨神经切片显示,雷帕霉素组和单纯手术组自噬体的数目明显增加,分别是对照组的8倍和3倍(P<0.05);3-MA处理组自噬数目明显减少(P<0.05);这些数据表明:外周神经损伤后,自噬功能会增强,自噬特异性蛋白LC3B-Ⅱ的Western blot蛋白印迹条带和免疫荧光检测均显示,在坐骨神经损伤早期,雷帕霉素组和单纯手术组自噬特异性蛋白LC3B-Ⅱ表达明显增高(P<0.05),3-MA处理组自噬特异性蛋白LC3B-Ⅱ表达明显降低(P<0.05)。(2)外周神经损伤后,自噬促进神经运动功能的恢复;使用Catwalk步态分析大鼠运动功能恢复情况,在造模1周、2周、3周和6周后,大鼠伤肢脚步平均站立时间和脚印平均强度被检测记录,进行统计分析。在造模1周和2周,雷帕霉素处理组大鼠脚步平均站立时间是单纯手术组的2倍(P<0.05);同时,在造模后2周,雷帕霉素组大鼠脚印平均强度比单纯手术组明显增高(P<0.05)。数据表明:雷帕霉素处理组大鼠在坐骨神经损伤后1-2周能更好地支撑身体。相反地,相对于单纯手术组,3-MA处理组大鼠在造模后1周和2周,脚步平均站立时间和脚印平均强度明显减少(P<0.05)(3)外周神经损伤后,自噬促进神经轴突再生和施旺细胞再髓鞘化;MBP是由施旺细胞分泌的特异性蛋白,而NF-200是神经轴突生长发育的重要蛋白。本研究应用免疫荧光对MBP蛋白和NF-200蛋白表达情况进行了检测。造模一周后,在神经再生发育高峰,相对于单纯手术组,雷帕霉素处理组MBP蛋白和NF-200蛋白表达明显升高(P<0.05),而3-MA处理组MBP蛋白和NF-200蛋白表达明显下降(P<0.05);造模后6周,伤段坐骨神经在电镜下检测髓鞘和轴突再生情况,以G-ratio比率进行评价,电镜结果显示,3-MA处理组和单纯手术组小直径4 μm)的轴突数目比雷帕霉素处理组数目更多;3-MA处理组和单纯手术组G-ratio比率为0.59-0.68,意味着轴突再生和髓鞘成熟受到抑制,而在雷帕霉素组,G-ratio比率为0.73-0.83,结果表明,抑制自噬,轴突和髓鞘再生受到抑制,而激活自噬,轴突和髓鞘再生能力增强。(4)外周神经损伤后,自噬增强施旺细胞存活。自噬的细胞保护作用通过TUNEL细胞凋亡染色进行评价,造模1周后,雷帕霉素组TUNEL染色阳性细胞数目明显比单纯手术组和3-MA处理组减少,表明在坐骨神经损伤后,增强自噬能促进施旺细胞存活。实验结论:在外周神经损伤早期,雷帕霉素激活自噬促进神经轴突的再生与髓鞘的再生修复,并且有利于远期神经运动功能的恢复。自噬在神经损伤后,对神经再生修复和运动功能恢复起到重要的促进作用。在外周神经损伤早期,药理性激活自噬将为神经损伤修复治疗提供新的思路。