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金华猪是我国优良的地方家畜种质资源之一,加强金华猪的保护对畜牧业发展具有重要的意义。成纤维细胞系的建立使金华猪种质资源在细胞水平上得以保护,一方面为畜禽资源的保护提供新的途径,另一方面为细胞生物学、胚胎克隆以及转基因研究提供必要的研究材料。此外,本成纤维细胞系的成功建立可以为以后其它种质资源在细胞水平上的保存提供理论与技术支持。
研究以40日龄金华猪胎儿为试验材料,采用组织贴壁法建立了金华猪胎儿成纤维细胞系,并对所建细胞系进行了形态学、生长动力学、细胞活力、染色体、同工酶、微生物污染、细胞凋亡、pEGFP-N3基因转染等生物学特性研究。
经形态学观察发现所培养细胞呈长梭形即典型的成纤维细胞状;原代细胞生长迅速,贴壁后2-3d可长满培养瓶,获得的成纤维细胞生长态势良好;细胞生长曲线呈典型的“S”形,与其它成纤维细胞的生长趋势相同;细胞的细菌、霉菌和支原体三项微生物检测均为阴性,表明培养细胞未受到上述三种微生物的污染。
细胞冻存前后检测发现金华猪胎儿成纤维细胞冻存前及复苏后细胞的活率分别为95.2%、92.8%,复苏后细胞活率有所下降,主要原因是冻存复苏时遭受化学与机械损伤所致。在对培养细胞冻存过程中以未冻存细胞为对照组探讨了两次冻存对细胞凋亡的影响,发现冻存复苏后细胞的凋亡程度会升高,第一次冻存后细胞凋亡程度大于未冻存细胞,第二次冻存细胞的凋亡程度又明显的高于第一次冻存细胞。
通过试验表明秋水仙素浓度及作用时间是影响制作细胞染色体标本成功与否的关键因素,在本研究中当秋水仙素浓度为0.4μg/ml作用细胞6h后得到的染色体标本效果较好。染色体标本分析表明,成纤维细胞染色体数2n=38,并且2n=38所占的比例为91%,达到了建系的要求;用低离子强度聚丙烯酰胺凝胶电泳法成功分离细胞的LDH及MDH同工酶,经酶谱分析表明所培养的细胞没有受到其它细胞的污染。
对金华猪胎儿成纤维15代细胞凋亡率进行检测,结果仅为2%,说明细胞没有大规模的凋亡发生。用脂质体介导绿色荧光蛋白基因转染金华猪成纤维细胞,结果显示当用0.3μl脂质体介导0.5μg绿色荧光蛋白质粒48 h后绿色荧光蛋白的转染效率最高,可达32.4%,说明当DNA和脂质体有合适的剂量配比时细胞的转染效率可以达到较高水平。