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河豚毒素(TTX)是一种神经性毒素,剧毒,它是一种阻断剂,妨碍Na+的传导,一般情况下是“两性离子”的存在形式。其毒性比氰化钾还要强1000多倍。由于河豚肉新鲜美味,食用它的人很多,沿海地区和日本需求量较大。因此每年因食用河豚鱼而导致中毒乃至死亡的事件特别多。但是随着对其研究的逐渐深入以及海洋药物不断被开发和利用,TTX在医学领域的作用渐渐变广泛,而且在神经学领域以及生物学研究等方面也有应用。TTX不仅存在于河豚鱼鱼体中,还存在于许多其他动物体中(脊椎或是无脊椎动物)。至于TTX的起源问题长时间以来存在着争议,现在微生物起源假说更为人们所接受。依据微生物在毒素降解方面的作用,特别是对和TTX具有相似结构的物质如石房蛤毒素的降解作用,本实验主要为了研究酒醅中所含微生物对TTX降解的可能性,并探讨酒醅降解TTX的原因。 以山西杏花春汾酒有限公司提供的酒醅为降解材料,利用免疫层析检测法对酒醅降解后的河豚毒素进行检测。 为优化酒醅对河豚毒素的降解条件,本实验以酒厂酿酒发酵了24天的酒醅为降解材料,用免疫层析检测法来考察酒醅添加量、降解温度、降解时间、摇床转速等因素对TTX降解效果的影响,最后在最优因素条件下,用小鼠生物法评价酒醅对TTX的降解效果。实验结果表明:当酒醅添加量为16g,温度为30℃,摇床转速为50r/min的条件下,酒醅降解TTX的能力最强;在上述最优条件下,随着TTX降解时间的增加,昆明鼠的死亡时间被不断地延长,在第五天之后便保持不变。 实验中用酒醅降解河豚卵巢,结果卵巢的毒性有下降。进一步证实了在现实生活中用酒醅来降解河豚鱼废弃器官防止环境二次污染的可能性。对酒醅微生物进行分离培养之后到了革兰氏阳性芽孢菌(细菌类),两种主要霉菌和酵母菌。同时对酒醅发酵过程中的含水量和酸度进行了测试,发现含水量不断在增加,最后才下降,而酸度则刚开始稍微下降后又不断上升。由于含水量和酸度的变化与酒醅中微生物数量的变化有很大的关系,酒醅中含水量的增加和酸度的先下降后上升,都是酒醅中微生物数量增多的缘故。用酒醅中分离培养得到的四种微生物来降解河豚毒素,没有看到毒性的变化,用四种微生物(根霉,曲霉,青霉,乳酸菌)来降解河豚毒素也没有看到效果。一个原因可解释为单株菌对河豚毒素没降解能力,第二个原因可能是是这些菌都不是降解河豚毒素的优势菌株。第三个原因可能是微生物不是降解河豚毒素的原因,真正有降解作用的是酒醅发酵过程中产生的活性酶等物质。 为了区别生物转化作用和物理吸附作用。以PBS溶液为阴性对照,对重复洗了三次的酒醅离心后的剩余固体中所含河豚毒素进行试纸条检测,测磁信号值。结果发现两者的T线和C线的磁信号值相差不大,也就是说在酒醅降解离心后的固体中几乎检测不到河豚毒素的存在。因为微生物吸附作用是个可逆的过程,用溶液洗涤后,被吸附的毒素可重新溶解到溶液中。本实验在离心固体的洗涤液中检测不到河豚毒素,这就可以排除是微生物吸附结合河豚毒素的原因,所以酒醅降解河豚毒素是一个生物转化的作用,可能是微生物转化的作用,也有可能是酒醅发酵过程中产生的活性物质的降解作用。 从酒醅,酒醅上清液,破碎酒醅上清液对河豚毒素的降解结果来看。他们的降解能力没有很大区别。酒醅与酒醅上清液的降解结果一样表示酒醅能够降解河豚毒素不是细菌的作用,可能是酒醅发酵过程中产生的一种活性物质具有降解作用,酒醅上清液与破碎酒醅上清液的降解结果一样则说明能够降解河豚毒素的物质是产生于胞外,而非胞内。用竞争性ELISA方法比较酒醅上清和破碎酒醅上清的降解作用,结果显示两者的降解效果之间没显著差异性,这进一步说明了降解河豚毒素的物质产生于胞外,而非胞内。