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目的补肾固表颗粒是徐氏儿科治疗反复呼吸道感染的经典方,反复呼吸道感染的主要病因为免疫功能低下及紊乱,本实验通过腹腔注射环磷酰胺建立免疫低下小鼠模型,以补肾固表颗粒灌胃给药4周,以玉屏风颗粒为对照组,研究补肾固表颗粒对免疫低下小鼠免疫功能的调节作用,并通过最大给药量对补肾固表颗粒进行安全性评价。为补肾固表颗粒防治反复呼吸道感染及临床用药的安全性提供理论和实验依据。方法实验一:将60只清洁级雄性ICR小鼠随机分成6组,即空白对照组,模型组,玉屏风颗粒组,补肾固表颗粒低剂量组、补肾固表颗粒中剂量组、补肾固表颗粒高剂量组,每组10只。除空白组外,其他各组给予环磷酰胺腹腔注射,按50mg/kg/d,连续3d,建立免疫低下小鼠模型。造模成功后,各组给予相应药物灌胃,补肾固表颗粒低、中、高剂量组分别按4.5g/kg/d、9g/kg/d和18g/kg/d灌胃给药;阳性对照药玉屏风颗粒按2.25g/kg/d给药,模型组及空白对照组给予生理盐水,灌胃体积均为0.5mL/次,每日2次,连续4周。最后一次给药后,撤除饲料,自由饮水。次日小鼠麻醉后,摘除眼球取血,室温静置2h后放入离心机中离心,转速2500r/min,离心15分钟,吸取上清液分装于0.3mL的离心管中,-80℃冰箱保存备用,冻存的血清将用来检测TNF-α、IL-2及IFN-γ水平等免疫指标。解剖小鼠,摘取小鼠脾脏用电子天平称重,计算实验后各组小鼠脾脏系数,随后提取小鼠脾淋巴细胞,检测脾淋巴细胞增殖能力、NK细胞杀伤活性。实验二:选取清洁级ICR小鼠40只,体重18~22g,雌雄各半,按体重随机分为2组,即空白组、给药组,每组20只。给药组以补肾固表颗粒最大浓度(1mL含1.71g生药)和最大灌胃体积(0.4ml/10g),一日2次,间隔6小时灌胃,对照组给予等体积等次数的生理盐水灌胃。连续观察14天,观察并记录动物异常现象(精神状态、活动、皮毛情况、粪便等分泌物)、体重变化和死亡情况等,对观察期间死亡小鼠及时进行解剖观察,其余小鼠在观察期结束后进行解剖观察,有异常变化时做病理组织检测。结果1.小鼠体重变化:与空白对照组比较,环磷酰胺模型小鼠体重减轻,差异具有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,灌胃给药后,玉屏风颗粒组、补肾固表颗粒各剂量组小鼠体重均增加(P<0.05),差异具有统计学意义;补肾固表颗粒低、中、高剂量组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。2.脾脏系数:与空白对照组比较,环磷酰胺模型小鼠脾脏系数减低;与模型组比较,灌胃给药后,玉屏风颗粒组、补肾固表颗粒各剂量组小鼠脾脏系数均增加(P<0.05),差异具有统计学意义;补肾固表颗粒低、中、高剂量组之间的量效关系比较,差异不具有统计学意义(P>0.05)。3.小鼠脾淋巴细胞增殖能力:与空白对照组比较,环磷酰胺模型组小鼠脾淋巴细胞增殖能力显著下降(P<0.01)。与模型组小鼠相比,灌胃给药后补肾固表颗粒各剂量组及玉屏风颗粒组脾淋巴细胞的增殖能力提高,并接近正常水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.小鼠NK细胞杀伤活性:与空白对照组比较,模型组小鼠NK细胞杀伤活性降低,其差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,灌胃给药后补肾固表颗粒各剂量组及玉屏风颗粒组NK细胞杀伤活性增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。补肾固表颗粒高剂量组杀伤活性强于低剂量组和玉屏风颗粒组,差异具有统计学意义(P<0.05)。5.血清IL-2、IFN-γ及TNF-α水平变化:与空白对照组比较,模型组小鼠血清IL-2、IFN-γ水平降低,TNF-α水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05),给药后,补肾固表颗粒各剂量组及玉屏风颗粒组血清IL-2、IFN-γ水平升高,TNF-α水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。补肾固表颗粒中、高剂量组升高IL-2水平优于玉屏风颗粒组(P<0.05)。补肾固表颗粒中、高剂量组升高IFN-γ水平优于低剂量组(P<0.05)补肾固表颗粒各剂量组间TNF-α水平量效关系比较,差异无统计学意义(P>0.05)。6.急性毒性实验组小鼠给药数分钟后,小鼠活动稍减,4小时后恢复正常。给药第2天小鼠食量明显下降,随后即增长,无其他异常表现。观察期间小鼠体重总体呈增长趋势。通过统计学分析,提示差异无统计学意义(P>0.05)。观察期内,小鼠毛色光亮,无兴奋、躁动、竖毛、凸眼、扭体等反应;摄食、饮水、大小便等均无明显异常。无小鼠死亡。观察14天后,对小鼠进行解剖,肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、胃、肠道等脏器,均未见出血、充血、水肿等明显的病理变化。结论1.采用腹腔注射环磷酰胺能够建立免疫低下小鼠模型,造模后小鼠饮食减少,扎堆明显,体重下降,脾脏系数减低,脾淋巴细胞增殖能力、NK细胞杀伤活性减低,说明环磷酰胺造模成功。2.补肾固表颗粒能明显增强免疫低下小鼠脾淋巴细胞增殖能力、NK细胞杀伤活性,提高机体细胞免疫能力。3.补肾固表颗粒可以提高免疫低下小鼠血清IL-2和IFN-γ水平,降低TNF-α水平,通过调节细胞因子水平,从而调节细胞免疫和体液免疫功能,增强机体的免疫力。4.补肾固表颗粒常用剂量口服给药安全。