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背景脊髓损伤(Spinal cord injury, SCI)是中枢神经系统的严重创伤,人脐带间充质干细胞(Human umbilcal cord stem cell, HUC-MSCs)对SCI的治疗有一定的效果。有研究发现,神经营养因子-3(Neurotrophin factor-3, NT-3)与白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor, LIF)基因对神经系统有修复创伤和维持神经元生存的作用。因此,LIF/NT-3双基因载体复合HUC-MSCs,能否增强脐带间充质干细胞的治疗效果是需深入探索的重要临床课题。目的本研究旨在通过克隆人LIF与NT-3基因,构建LIF-IRES-NT-3双基因载体并整合到HUC-MSCs基因组中,获得过表达LIF和NT-3基因的HUC-MSCs,为干细胞移植治疗中枢神经系统疾病特别是脊髓损伤提供新的思路。方法1.以人血液单核细胞来源的人基因组DNA为模板,利用重叠PCR和姊妹PCR技术克隆人LIF和NT-3基因。2.利用基因工程技术,构建pIRES2-LIF-EGFP和pIRES2-LIF-IRES-NT-3真核表达载体。3.将筛选出的阳性质粒转染HEK293T细胞,通过RT-PCR和蛋白质印迹实验技术检测mRNA、蛋白质的表达水平。4.利用基因工程技术,获取LIF和LIF-IRES-NT-3基因片段,构建pCDH-LIF和pCDH-LIF-IRES-NT-3质粒。5.将构建的pCDH-LIF和pCDH-LIF-IRES-NT-3重组质粒与慢病毒包装质粒pVSVG、Δ8.91共转染HEK293FT细胞,收集慢病毒上清,浓缩后将获得的慢病毒颗粒转染HEK293FT细胞,通过RT-PCR和蛋白质印迹实验技术检测mRNA、蛋白质的表达水平。6.将鉴定过的慢病毒颗粒转染HUC-MSCs,检测LIF和NT-3基因：mRNA的表达。结果1.成功克隆人LIF和NT-3基因,测序结果显示与Genbank基因库序列一致。2.成功构建pIRES2-LIF-EGFP和pIRES2-LIF-IRES-NT-3真核表达质粒,转染HEK293T细胞后,检测mRNA和蛋白质表达水平,结果显示转基因组均有明显提高。3.成功构建pCDH-LIF、pCDH-LIF-IRES-NT-3慢病毒表达质粒,包装出含LIF和LIF-IRES-NT-3的慢病毒颗粒,转染HEK293FT细胞,检测mRNA和蛋白质表达水平,转基因组较空白和空病毒有明显提高。4.将慢病毒颗粒转染HUC-MSCs,转基因组mRNA表达水平较空白和空病毒有明显提高。结论成功构建含LIF和LIF-IRES-NT-3基因的真核表达载体,包装出含LIF和LIF-IRES-NT-3基因的慢病毒颗粒,转染HUC-MSCs,检测结果较对照组有明显提高,提示可过表达LIF、NT-3两种因子。