禽流感（AI）是由甲型流感病毒引起的一种严重危害禽类健康的传染病。根据其病原致病力强弱，可分为高致病性禽流感(High pathogenic avian influenza, HPAI)和低致病性禽流感（Low pathogenic avian influenza, LPAI）。H9N2亚型禽流感病毒（AIV）是甲型流感病毒其中一个亚型，属于低致病性AIV，但当它与其他病原混合感染时，会引起家禽高致病率和死亡率。除此之外，H9N2亚型AIV可以跨种间传染传播到猪和人，与此同时（2009）新型甲型H1N1流感病毒已经在人群和哺乳动物中广泛流行，且已经在猪群中存在。猪作为流感病毒的基因“混合器”，既可以感染禽流感病毒又可以感染人流感病毒，这就为流感病毒的重组提供了有利条件。因此，在自然界中，这两种亚型的病毒有很大的机会发生重组产生新的病毒，对人类的健康造成潜在的威胁。　　已有研究证明H1N1流感病毒与H9N2亚型AIV基因兼容性非常高，两株病毒很容易发生重组，重组后的病毒容易感染小鼠且部分重组病毒较两株亲本病毒相比致病力明显提高。通过对强毒力病毒的基因分析发现其PA基因均来自于H1N1流感病毒。2009年H1N1流感爆发后，对病毒的基因组分析发现其PA基因源自北美的禽源流感病毒。且有研究证明将人类H1N1流感病毒的PA基因引入禽类聚合酶中后可克服禽类聚合酶活性在人类细胞的限制。因此，聚合酶PA基因在病毒的宿主适应性及毒力方面起着重要作用。基于此，本研究利用反向遗传操作技术，将H9N2亚型AIV与H1N1流感病毒进行重组，构建了一株重组病毒rSD01-PA，其PA基因来源于H1N1流感病毒。以人肺腺癌上皮细胞（A549）以及鸡胚成纤维细胞（DF-1）为模型，通过绘制病毒在细胞上的生长曲线、间接免疫荧光和荧光定量 PCR 检测 H9N2 亲本株及重组株在 A549 细胞和DF-1细胞上的复制情况，以及相关模式识别受体和细胞因子的表达，来了解H9N2亚型AIV与及其重组株在不同宿主细胞上的复制情况，评估其感染力的变化，以及在不同时间引起的宿主的免疫反应。实验主要分为以下几个部分：　　一、重组病毒的拯救　　根据同源重组的原理，利用目的片段的引物（含有同源序列）及双向转录表达载体pHW2000，构建SD01株的八个质粒和SD07株的PA质粒，并进行测序验证。利用反向遗操作传技术，将SD01的除去PA的7个质粒以及SD07的PA质粒共转染293T细胞，拯救出新的重组病毒命名为rSD01-PA。测定SD01株和rSD01-PA株病毒的TCID50，结果显示，SD01株的TCID50为10-6.67/0.1 mL，而重组病毒rSD01-PA株的TCID50效价较亲本株相比有所提高，为10-7.39/0.1 mL。结果表明重组株的感染力有所上升。　　二、病毒在A549细胞和DF-1细胞上的复制能力的检测　　分别令H9N2亲本株SD01株及重组株rSD01-PA株感染A549细胞和DF-1细胞，在6 h、12 h、18 h、24 h、36 h和48 h六个时间点收取接毒的细胞。通过对其TCID50的检测，绘制两株病毒在A549细胞和DF-1细胞上的生长曲线。病毒感染细胞后12 h和24 h进行间接免疫荧光检测病毒在细胞上的复制情况。结果显示，在A549细胞的感染试验中，SD01 株和重组病毒 rSD01-PA 株在 A549 细胞上均能够有效复制，重组病毒rSD01-PA在各个时间点病毒滴度都较高，在12 h较明显，且在相同时间，rSD01-PA感染A549细胞后荧光数量也更多；在DF-1细胞的感染试验中，两株病毒在DF-1细胞上也能够有效复制，随着培养时间的延长，病毒滴度持续上升，在24 h后趋于平衡。在感染后12 h至24 h之间，SD01株的病毒滴度略高于rSD01-PA株。结果说明亲本株和重组病毒均能在这两种细胞上有效复制，且重组株 rSD01-PA 在 A549 细胞上复制能力更强，说明猪源H1N1 PA基因的引入增强了禽流感病毒在A549细胞上的复制能力。　　三、病毒诱导的模式识别受体及细胞因子表达量的检测　　H9N2亲本株SD01株及重组株rSD01-PA株感染A549细胞和DF-1细胞后，在不同时间点利用荧光定量 PCR 的方法检测模式识别受体及相关细胞因子表达量。结果显示，两株毒感染A549细胞后48 h内均能诱导4种模式识别受体和相关细胞因子表达量显著上调。其中rSD01-PA感染A549细胞诱导的模式识别受体TLR-3、TLR-7及炎性细胞因子如IL、IFN和MX的等基因的表达水平更高。重组株感染DF-1细胞后诱导的模式识别受体TLR-3、TLR-7及IFN-γ、MX、OAS和TNF-α的基因表达水平更高。在病毒感染这两种细胞过程中，抗病毒蛋白MX和OAS均显著上调，说明其在细胞抵抗病毒感染时发挥重要作用。