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研究背景和目的:随着人口老龄化、环境恶化等因素,全球器官衰竭的患者发病率逐年上升。同种异体移植是终末期器官衰竭的最有效的治疗方法,但移植供体器官极度的短缺严重制约移植治疗的发展。随着异种移植基础理论的发展、新型基因编辑技术及免疫抑制剂的问世,异种移植(如猪来源的器官)将解决同种异体移植中器官极度短缺的这一关键问题。目前猪供体器官-灵长类动物移植的研究取得巨大的进步,猪器官移植物存活率及存活时间大大增加,进一步将猪器官异种移植推向临床治疗提供理论及实践依据,但仍存在许多问题,如炎症反应,导致移植物发生免疫排斥反应,甚至失功能。白细胞介素-6(IL-6)作为参与各种炎性疾病的发生发展的重要的促炎细胞因子。研究证实IL-6通过结合IL-6受体α(IL-6 Rα)及IL-6受体β(gp130),进而激活信号转导和转录激活因子3磷酸化(p-STAT3),从而将信号转导到细胞核中发挥促炎、细胞增殖、免疫细胞活化及排斥反应等作用。IL-6 Rα单克隆抗体tocilizumab已批准用于某些自身性免疫性疾病的临床治疗(如自身免疫性关节炎,多中心型Castleman病)。我们前期试验发现tocilizumab导致猪器官异种移植受体(狒狒)体内的IL-6的表达升高,且并未显示明显抑制猪移植物中炎症反应的效果;同时有研究报道tocilizumab不能抑制IL-6诱导猪动脉内皮细胞p-STAT3的表达,因此我们假设异种移植中受体与猪器官移植物的IL-6 Rα存在物种差异性,tocilizumab不能封闭猪器官移植物中的猪源性IL-6 Rα,受体升高的IL-6持续激活猪器官移植物中的IL-6/猪源性IL-6 Rα/STAT3信号通路,导致猪器官移植物失功能。本研究主要探讨是(I)体内研究tocilizumab抑制IL-6激活IL-6/IL-6Rα/STAT3信号通路的机制;(II)体外研究tocilizumab抑制IL-6激活不同种属细胞的IL-6/IL-6 Rα/STAT3通路的机制;(III)寻找抑制人或猪源性IL-6/人或猪源性IL-6 Rα/STAT3信号通路激活最佳策略;(IV)体外研究IL-6诱导猪内皮细胞的下游相关基因表达的情况及相关抑制剂对IL-6诱导上述基因表达的抑制效果。方法:1、检测狒狒血清中的狒狒或猪源性IL-6的表达水平:23只接受猪器官移植的狒狒血清(其中14只为猪肾脏异种移植,另9只为猪心脏异种移植),其中16只同时接受tocilizumab处理(其中14只为猪肾脏异种移植,另2只为猪心脏异种移植),另7只未予tocilizumab处理;使用基于流式细胞仪的液相蛋白定量技术(CBA)检测23只狒狒的血清中狒狒源性IL-6的表达水平;使用ELISA检测14只接受猪肾脏异种移植及tocilizumab处理的狒狒的血清中的猪源性IL-6的表达水平。分析狒狒血清中狒狒源性IL-6的表达水平与tocilizumab处理的关系;观察同时接受猪肾脏异种移植及tocilizumab处理的狒狒体内猪源性IL-6的表达水平的变化。2、接受猪肾异种移植及tocilizumab处理的狒狒的肾移植物(n=10)及肝组织(n=7),阴性对照(正常肾肝组织)及阳性对照(1只接受猪肾异种移植术后发生超急性排斥反应的狒狒的猪肾移植物及肝组织,另一为1只接受移植前免疫抑制诱导治疗时导致严重的毒性反应死亡的狒狒的肾及肝组织),使用免疫组化检测肾移植物和肝组织中IL-6和p-STAT3的表达情况,分析两者在供体猪肾移植物及受体肝组织中的表达与tocilizumab处理的关系。3、利用不同浓度的重组人或猪源性IL-6,不同的时间刺激猪动脉内皮细胞及人动脉内皮细胞,利用流式细胞仪检测p-STAT3的表达,从而确定最佳的IL-6刺激浓度及时间。4、体外研究tocilizumab抑制IL-6/IL-6 Rα/STAT3信号通路的机制:利用不同浓度的tocilizumab封闭人、狒狒及猪外周血单核细胞的IL-6 Rα,利用流式细胞仪检测IL-6 Rα的表达水平及表达IL-6 Rα的相应细胞亚群,以评估tocilizumab封闭IL-6 Rα的效果及种属特异性;不同浓度的tocilizumab抑制重组人或猪源性IL-6(20ng/mL,15min)激活人或猪动脉内皮细胞的STAT3信号通路,利用流式细胞仪检测p-STAT3表达强度,从而评估tocilizumab抑制重组人或猪源性IL-6激活人或猪动脉内皮细胞的STAT3信号通路的效果;进一步验证不同浓度的tocilizumab抑制重组人或猪源性IL-6(20ng/mL,15min)激活人、狒狒及猪外周血单核细胞的STAT3信号通路,利用流式细胞仪检测p-STAT3的表达,从而评估tocilizumab抑制不同种属免疫细胞中STAT3信号通路的效果。5、体外研究siltuximab抑制IL-6/IL-6 Rα/STAT3信号通路的机制:利用不同浓度的siltuximab抑制重组人或猪源性IL-6(20ng/mL,15min)激活人或猪动脉内皮细胞的STAT3信号通路,利用流式细胞仪检测p-STAT3的表达,评估siltuximab中和重组人或猪源性的IL-6的效果及种属特异性;体外验证狒狒来源的IL-6是否可以激活猪动脉内皮细胞STAT3信号通路,同时CBA检测体外siltuxiamb中和狒狒源性IL-6的效果;不同浓度的siltuximab抑制重组人或猪源性IL-6(20ng/mL,15min)激活狒狒外周血单核细胞的STAT3信号通路,同样利用流式细胞仪检测p-STAT3表达强度,从而评估siltuxiamb抑制重组人或猪源性IL-6激活狒狒外周血单核细胞的STAT3信号通路的效果。6、体外研究雷帕霉素抑制IL-6/STAT3信号通路激活的机制:首先利用不同浓度雷帕霉素作用于人或猪动脉内皮细胞24小时后,然后使用重组人或猪源性IL-6(20ng/mL,15min)激活人或猪动脉内皮细胞的STAT3信号通路,最后利用流式细胞仪检测p-STAT3的表达,从而评估雷帕霉素抑制IL-6激活STAT3信号通路的效果。7、利用qPCR检测siltuximab或雷帕霉素对IL-6通过IL-6/IL-6 Rα/STAT3信号通路诱导猪内皮细胞的下游相关因子的mRNA表达的抑制作用。结果:1、23只接受猪肾或者心脏移植的狒狒血清中的狒狒源性IL-6的表达水平从免疫抑制诱导治疗后逐渐升高。进一步分析tocilizumab对接受猪器官异种移植的狒狒体内IL-6的表达水平的影响,数据显示在Day 0(移植前,但在免疫抑制诱导治疗后)接受tocilizumab处理的狒狒血清中狒狒源性IL-6的表达水平显著高于未接受tocilizumab处理的狒狒的IL-6的表达水平(255 vs 35 pg/mL,p<0.05)。由于猪肾移植组缺乏对照组,我们仅分析了猪心脏移植组,Day 1(移植术后第1天)时,接受tocilizumab处理的狒狒血清中狒狒源性IL-6的表达水平显著高于未接受tocilizumab处理的狒狒(183 vs 23 pg/mL,p<0.01);同时数据也显示接受tocilizumab处理的猪肾移植组显著高于接受tocilizumab处理的猪心脏移植组(p<0.05)。在安乐死时(Euthanasia),接受tocilizumab处理的猪肾移植组狒狒血清中狒狒源性IL-6的表达水平显著升高,但与Day 1时狒狒源性IL-6的表达水平无统计学差异。为了确定猪肾移植物是否产生猪源性IL-6,我们检测Day 0、Day 1及安乐死三个时间段狒狒血清中猪源性IL-6的含量,Day 0时狒狒血清中无法检测到猪源性IL-6,而在Day 1和安乐死时狒狒血清中均检测到了猪源性IL-6(均为p<0.05),但Day 1与安乐死时猪源性IL-6的表达水平没有统计学差异。我们利用免疫组化检测猪肾移植物及狒狒肝组织中的IL-6及p-STAT3表达,其中阴性对照的正常猪肾肝组织中IL-6及p-STAT3呈低表达或者不表达;两例阳性对照的肾肝组织中IL-6及p-STAT3的表达呈强阳性;10例接受猪肾移植及tocilizumab处理的狒狒的猪肾移植物中的IL-6及p-STAT3阳性表达率无统计学差异,其中IL-6阳性表达率90%,p-STAT3阳性表达率为60%;7例接受猪肾移植及tocilizumab处理的狒狒的肝组织中IL-6及p-STAT3表达的阳性率存在统计学差异(p<0.001),其中IL-6阳性表达率高达85.7%,p-STAT3阳性表达率仅为28.6%。2、我们确定重组人或猪源性IL-6最佳的激活IL-6/IL-6 Rα/STAT3信号通路的浓度及时间(20ng/mL,15min)。Tocilizumab可以封闭人和狒狒外周血单核细胞IL-6 Rα(主要为CD3~+T细胞和单核细胞),却不能封闭猪外周血单核细胞的IL-6 Rα。Tocilizumab可以完全抑制重组人或猪源性IL-6诱导人动脉内皮细胞p-STAT3的表达(最佳浓度为12.5μg/mL),但不能抑制重组人或猪源性IL-6诱导猪动脉内皮细胞(无论是野生型还是GTKO/CD46)的p-STAT3的表达(即使最高浓度312.5μg/mL)。Tocilizumab同样可以抑制重组人或猪源性IL-6诱导人、狒狒外周血单核细胞中CD3~+T细胞和单核细胞的p-STAT3的表达(浓度12.5μg/mL),同样不能抑制重组人或猪源性IL-6诱导猪外周血单核细胞的p-STAT3的表达。3、Siltuximab可以完全中和重组人源性IL-6,从而抑制其诱导人或猪动脉内皮细胞p-STAT3的表达(最佳浓度为12.5μg/mL),但不能中和重组猪源性IL-6及抑制其诱导人或猪动脉内皮细胞p-STAT3的表达(即使最高浓度312.5μg/mL)。同时数据显示siltuximab可以显著抑制狒狒源性IL-6诱导猪动脉内皮细胞的p-STAT3的表达,尽管体外中和试验显示siltuximab不能完全中和狒狒源性IL-6。Siltuximab同样显示仅可以抑制重组人源性IL-6诱导狒狒外周血单核细胞中CD3~+T细胞和单核细胞的p-STAT3的表达(浓度12.5μg/mL),而不能抑制重组猪源性IL-6诱导狒狒外周血CD3~+T细胞和单核细胞的p-STAT3的表达(即使最高浓度312.5μg/mL)。4、雷帕霉素(40ng/mL,24h)不仅可以抑制重组人源性IL-6诱导猪动脉内皮细胞p-STAT3的表达(p<0.01),也可以抑制重组猪源性IL-6诱导猪动脉内皮细胞p-STAT3的表达(p<0.01)。我们发现雷帕霉素(40ng/mL,24h)同样可以抑制重组人或猪源性IL-6诱导人动脉内皮细胞p-STAT3的表达(p<0.05,p<0.01)。5、重组人或猪源性IL-6可以诱导猪动脉内皮细胞上调E-selectin、ICAM-1、VEGF及FGF2 mRNA表达水平,siltuximab可以有效的抑制重组人源性IL-6诱导猪动脉内皮细胞的上述4种基因的上调,而雷帕霉素可以显著抑制重组人或猪源性IL-6诱导猪动脉内皮细胞VEGF、FGF2 mRNA上调,但仅能轻度抑制或者不能抑制E-selectin、ICAM-1 mRNA上调。结论:1、在跨种属的异种移植中,IL-6和IL-6 Rα的存在种属差异性,导致IL-6/IL-6Rα/STAT3通路存在较大差异。2、Tocilizumab可以引起受体IL-6水平升高,同时tocilizumab不能阻断猪器官移植物中的猪源性IL-6 Rα,升高的IL-6持续激活猪器官移植物的IL-6/猪源性IL-6 Rα/STAT3信号通路,从而导致猪器官移植物失功能。3、在猪器官人或狒狒异种移植中,将siltuximab和雷帕霉素相结合的策略可有效抑制人或猪源性IL-6/人或猪源性IL-6 Rα/STAT3信号通路。4、在猪器官人或狒狒异种移植中,IL-6、IL-6 Rα存在种属差异性,开发兼顾人、狒狒及猪源性IL-6或者IL-6 Rα的单克隆抗体具有远大的前景。