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中国心脑血管患病及死亡率逐年攀升,占居民疾病死亡构成的40%,住院总费用每年超过千亿。建立以患者为中心,以高血压、血脂异常等危险因素管理为突破口的全程综合防治管理模式,是开展重大心脑血管疾病一级预防的关键。单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism,SNP）已广泛用于疾病诊断、疾病易感性评估、药物遗传学分析等领域。常用SNP检测技术包括测序、实时荧光PCR、DNA芯片杂交、质谱等,可为临床提供准确的基因检测结果,但须依赖昂贵的设备、专业的人员,操作步骤繁琐,检验结果回报时间（Turn-Around Time,TAT）长,因而在资源有限的实验室普及应用受到一定限制。为此,亟需开发快速准确、操作简单、性价比高的分子诊断适宜技术,可应用各级医疗机构、基础临床实验室、疾控中心等多种场合,特别是可利于对大规模人群进行风险基因的快速筛查,以及时干预心脑血管慢性疾病,实现个性化预防和治疗。2007年起,侧向流层析技术（Lateral Flow Assay,LFA）被用于SNP检测领域。通过LFA装置对等位基因特异性产物分析,可快速读取基因型结果。与已有SNP检测方法相比,其检测成本低,不需要昂贵的仪器设备,操作人员易于培训,适用于多种场景应用。然而在获取等位基因特异性产物时,均需要先PCR扩增目的片段,再进行等位基因区分。如何建立PCR扩增与等位基因区分同时完成,再结合层析装置实现SNP检测简化步骤,缩短TAT,对方法学进一步改进意义重大。在国家重大新药创制课题支持下,本论文首次建立扩增受阻突变体系PCR（Amplification refractory mutation system,ARMS-PCR）结合金磁微粒层析装置（GoldMag-LFA）进行SNP分型,称ARMS-PCR-金磁微粒层析法。可通过一步扩增,同时进行目的片段获取与等位基因区分,再利用金磁微粒层析装置对结果进行判读。利用该方法实现了叶酸代谢关键酶基因多态性MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRR A66G的检测。该方法准确、简便、快速,使用该技术研制的MTHFR C677T基因检测试剂盒于2014年被国家药监局认定为“国家创新医疗器械产品”,并已应用于临床检验和大规模筛查。同时,课题组其他成员也将该技术应用于CYP2C19、ApoE、PLD3、ALDH2等多个SNP位点检测方法的建立。初始设计的ARMS-PCR-金磁微粒层析法,对于单个SNP位点,采用两管PCR扩增反应和两个层析装置,分别实现野生型和突变型等位基因检测,且保证SNP检测的特异性、灵敏度和准确度。在此基础上,本论文进一步建立四引物ARMS-PCR（Tetra-primer AMRS-PCR）和金磁微粒层析装置相结合的SNP检测方法,称T-ARMS-PCR-金磁微粒层析法。该法通过一管PCR反应和一个层析装置即可完成SNP分型。与ARMS-PCR-金磁微粒层析法相比,还可节省至少30%的检测时间。此外,T-ARMS-PCR-金磁微粒层析还实现了以全血作为模板直接进行扩增,省略了DNA提取步骤,大大缩短了SNP检测所需的时间,适于开发自动化平台,具有广阔的临床应用前景。论文具体研究内容包括:1.建立了双通道ARMS-PCR-金磁微粒层析法:基于一条共同引物和两条等位基因特异性引物的设计,通过两个ARMS-PCR反应实现了野生型和突变型等位基因的一步扩增,之后利用两个金磁微粒层析装置分别对野生型和突变型等位基因特异性产物进行检测。基于该原理,建立了MTHFR C677T、MTHFR A1298C及MTRR A66G三个SNP位点的检测方法。2.方法学的临床评价和临床应用:基于所建立双通道ARMS-PCR-金磁微粒层析平台,对MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G基因位点分别采用1000例以上临床样本进行验证,该方法与金标准测序的符合率可达99%以上。同时,设计病例-对照试验,对脑卒中患者和正常对照的MTHFR C677T/A1298C和MTRR A66G基因多态性进行检测,探讨这三个基因多态性与陕西汉族人群中同型半胱氨酸（Homocysteine,Hcy）水平及缺血性脑卒中（Ischemic stroke,IS）发病风险的相关性。结果表明MTHFR C677T/A1298C和MTRR A66G基因多态性与IS的发生具有显著相关性。可见在IS的高风险人群,如高血压、高血脂患者进行这三个位点的筛查,对于预防缺血性脑卒中有重要意义。3.开展了双通道ARMS-PCR-金磁微粒层析法与光学读卡仪的适配研究:设计了读卡仪的结果判读流程,并通过检测已知不同基因型的样本,得到结果判读流程中所需要关键参数,完成了试剂检测卡与仪器的适配。使用读卡仪对500例样本进行验证,检测结果与测序符合率达100%。完成准确性评估后,将读卡仪应用到临床样本的基因分型检测。4.建立了单通道T-ARMS-PCR-金磁微粒层析方法:与双通道ARMS-PCR-金磁微粒层析技术不同,该方法基于四条引物设计（包括突变型引物对和野生型引物对）,在单个PCR反应管中实现两个等位基因的同时扩增和识别,并通过一个金磁微粒层析装置,完成野生型和突变型等位基因特异性产物的同时检测。该方法可在75 min内完成对全血样本的基因检测,无需提取DNA。综上所述,本研究先后建立了双通道ARMS-PCR-金磁微粒层析法与单通道T-ARMS-PCR-金磁微粒层析法。双通道ARMS-PCR-金磁微粒层析法完成了规模化中试放大并在临床中得到大量SNP检测应用,还可通过配套光学读卡仪对临床样本快速筛查进行数据化处理。T-ARMS-PCR-金磁微粒层析法更加快速简便,应用前景广阔。所建立的方法不依赖昂贵的仪器,可适用于多种医疗机构。使用ARMS-PCR-金磁微粒层析技术平台有助于高血压患者MTHFR C677T/A1298C和MTRR A66G基因多态性的快速筛查,对潜在患病人群进行危险分层,聚焦重点人群,更好地开展用药干预和疾病管理,做好脑卒中一级预防工作。