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目的课题组前期通过蛋白质组学技术筛选出的核仁磷酸蛋白(Nucleophosmin,NPM,B23)在耐药的急性白血病患者中高表达,推测该蛋白的高表达可能与白血病的耐药机制相关。本课题旨在构建NPM基因稳定沉默的急性淋巴细胞白血病细胞系CA46及Jurkat细胞模型,研究沉默NPM后对CA46及Jurkat细胞株增殖、凋亡、药物敏感性等的影响,初步探讨NPM基因沉默对白血病细胞药物敏感性影响的可能机制。方法1.设计并构建针对NPM的小干扰RNA载体,包装慢病毒,分别转染CA46及Jurkat细胞,并检测其转染效率及干扰效率。2.应用MTT法和细胞克隆形成实验检测CA46及Jurkat细胞增殖变化。3.应用流式细胞术分析细胞凋亡,Western blot法研究凋亡相关蛋白的变化。4.应用MTT法检测NPM基因沉默后对白血病细胞阿霉素的敏感性(IC50),并用Western blot、实时荧光定量PCR技术法检测耐药相关蛋白及m RNA的表达水平。5.Western blot法研究若干信号通路的变化以探讨细胞凋亡及耐药的可能机制。6.本文中以CON、NC、KD分别表示CA46及Jurkat细胞的空白对照组、插入无关序列的阴性对照组和NPM基因敲减实验组。结果1.成功构建NPM基因沉默的慢病毒表达载体(NPM-RNAi-LV),并成功构建 NPM基因稳定沉默的CA46和Jurkat细胞株。2.NPM基因沉默能够导致CA46及Jurkat细胞增殖减慢,细胞克隆形成能力受抑制。3.NPM基因沉默能够诱导CA46及Jurkat细胞凋亡现象增加,其中caspase-3前体下调,剪切体上调;PARP剪切体上调;Bcl-2抗凋亡蛋白下调;CA46/KD组细胞中caspase-9剪切体上调;Jurkat/KD组细胞中caspase-9前体下调。4.NPM基因沉默提高CA46及Jurkat细胞对阿霉素的敏感性,抑制NPM表达后,CA46细胞对阿霉素的IC50值由转染前的0.526±0.138μg/ml下降至转染后的0.099±0.025μg/ml,敏感性提高5.313倍;Jurkat细胞对阿霉素的IC50值由转染前的0.528±0.098μg/ml下降至转染后的0.223±0.031μg/ml,敏感性提高2.368倍。5.NPM基因沉默后,BCRP、LRP表达下调,CA46和Jurkat细胞中AKT/m TOR的信号分子的活化受到抑制,c-Myc、GST-π基因的表达下调。Jurkat细胞中还出现p-ERK信号分子下调。结论RNA干扰成功下调CA46/Jurkat细胞株中NPM基因的表达,并证实NPM基因沉默可以导致CA46/Jurkat细胞增殖减慢,诱导细胞凋亡增加,caspase家族与Bcl-2家族参与细胞凋亡的调控。沉默NPM基因能够提高CA46/Jurkat细胞对阿霉素的敏感性,下调耐药相关蛋白BCRP、LRP的表达,可能与PI3K/AKT/m TOR信号通路的受抑制和c-Myc、GST-π基因表达下调有关。在Jurkat细胞中除上述作用机制外,还可能与p-ERK信号分子下调有关。