AcMNPV IE-1对杆状病毒的病毒发生基质的形成具有重要作用

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苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)ie-1是一个极早期基因。ie-1基因位于AcMNPV基因组127198 nt~128946 nt之间,全长1749 bp,编码582个氨基酸,预计编码蛋白的分子量为66.8kDa。氨基酸序列分析表明,AcMNPV IE-1蛋白在鳞翅目昆虫杆状病毒中具有高度的保守性。   本研究利用ET-同源重组系统,在含有AcMNPV基因组的BacmidbMON14272中将ie-1基因成功敲除,构建出ie-1缺失型重组病毒。利用Bac-to-Bac系统,把ie-1基因以及绿色荧光蛋白基因(gfp)和多角体蛋白基因(polh)补回至ie-1缺失型重组病毒的多角体蛋白基因位点;同时,将gfp和polh也插入至bMON14272和ie-1缺失型重组病毒的多角体蛋白基因位点,构建出带有和polh标记的ie-1缺失型重组病毒,ie-1补回型重组病毒和野生型病毒。将3种病毒分别转染Sf9细胞,发现ie-1缺失型重组病毒不能产生有感染性的病毒粒子;而ie-1补回型重组病毒产生感染性病毒粒子的能力与野生型基本一致。将ie-1缺失型重组病毒转染后的Sf9细胞进行流式细胞仪FACSAriaⅡ的GFP(绿色荧光蛋白)分选和透射电镜观察,结果表明无论是转染后的24小时,48小时,还是72小时,细胞中都未形成病毒RNA转录、DNA复制以及核衣壳装配的核心区域——病毒发生基质,细胞的亚显微结构与未被病毒侵染的Sf9细胞一致;而对比野生型和ie-1补回型重组病毒侵染细胞的透射电镜结果,可以发现两者在细胞核中都出现了典型的网状的病毒发生基质,病毒的核衣壳、ODV和多角体结构也清晰可见。同时,以GFP的抗体为一抗,以偶联了胶体金颗粒的Protein-A为二抗的免疫电镜结果也表明了在被ie-1缺失型病毒成功转染上的Sf9细胞中,完全没有病毒发生基质的产生,没有宿主细胞被病毒侵染后的细胞核膨大现象,也观察不到任何子代病毒的产生和复制装配过程,从而证明ie-1基因的缺失直接影响了病毒发生基质的产生,并阻断了病毒后续的增殖过程。将ie-1基因的瞬时表达载体p18PiA转染Sf9细胞的电镜和免疫电镜实验发现,一些Sf9细胞的异染色质呈现分散的网状的重排现象。   以上结果表明,ie-1基因是杆状病毒生活周期中一个必需的极早期基因,它对宿主细胞异染色质的重排和病毒发生基质的产生与否具有重要的决定作用。
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