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目的本研究选用经典的Gao-Binge模型,以Lieber-De Carli酒精或对照液体饲料建立小鼠酒精诱导肝损伤模型,探究NK细胞在酒精性肝脂肪变性中的作用,为进一步研究酒精性肝脂肪变性的发病进程以及免疫靶向治疗提供一定的科研依据。方法选取6周龄的野生型C57BL/6J小鼠,采用Lieber-De Carli酒精或对照液体饲料喂养,将小鼠随机分组分为对照组(Control),酒精组(Et OH),酒精+NK清除组(Et OH+anti-As GM1),酒精+NK活化组(Et OH+poly I:C)。对照组小鼠喂食对照液体饲料,酒精组小鼠喂食含5%(v/v)酒精的酒精液体饲料。Et OH+anti-As GM1组小鼠是指在喂食酒精的基础上,通过腹腔注射anti-As GM1抗体靶向清除小鼠体内NK细胞,注射剂量为50ug/次/只,每3天注射一次,Et OH+poly I:C组小鼠是指在喂食酒精的基础上,通过腹腔注射poly I:C活化NK细胞,注射剂量为20mg/kg/次,每2天注射一次。每日记录小鼠体重及液体饲料消耗量,对照组小鼠按照酒精组小鼠消耗等热量的饲料进行喂养,以保证所有组别中小鼠在模型建立期间摄入相同的热量。喂养10天后,在第11天早上8:00,酒精组小鼠以5g/kg体重灌胃31.5%酒精,对照组小鼠则灌胃等热量麦芽糊精。灌胃9h后,收集小鼠血清用于检测谷丙转氨酶(ALT,Alanine transaminase)、甘油三酯(TG,triglyceride),收集肝脏组织用于检测TG含量、荧光定量PCR及流式细胞分析;另取一部分肝脏置于4%多聚甲醛固定,用于组织病理学检测肝脏脂肪变性及肝脏损伤状态,如HE染色。结果小鼠喂食酒精后,血清ALT显著上升,HE染色显示肝脏组织中有炎性细胞浸润,表明肝脏处于炎症损伤状态;此外,血清TG含量明显增高,肝脏组织中脂肪空泡及脂滴显著增加。与对照组相比,酒精组小鼠肝脏单个核细胞中NK细胞的比例和绝对数量均明显下降,提示NK细胞可能参与酒精性肝病的发生发展。通过腹腔注射anti-As GM1抗体清除NK细胞,我们发现小鼠喂食酒精后肝脏TG水平明显降低,组织病理学显示肝脂肪变性显著减弱,RT-q PCR结果表明促炎因子及脂肪合成相关酶的m RNA水平均明显下降,表明NK细胞缺失后能够显著抑制酒精诱导的肝脏脂肪变性。与对照组相比,酒精组NK细胞不但比例和数量显著下降,其细胞亚群构成也发生显著变化,表现为c NK细胞比例明显下降而Lr NK细胞比例明显增加。为了验证NK细胞在酒精性肝脂肪变性中的作用,小鼠在喂食酒精的基础上腹腔注射poly I:C以活化NK细胞,结果显示小鼠肝脏TG水平有下降趋势,组织病理学显示肝脏脂滴明显减少,流式结果显示,NK细胞亚群中c NK细胞百分比明显增加,表明NK细胞活化后c NK细胞增加能够减弱酒精诱导的肝脂肪变性。为了进一步验证c NK细胞能抑制酒精性肝脂肪变性,采用c NK细胞过继转输以增加受体小鼠肝脏内c NK细胞的数量,病理结果显示转输c NK细胞后肝脏脂肪变性明显减弱,表明c NK细胞在酒精诱导的肝脂肪变性中确实发挥重要的保护作用。此外,我们分析了NK细胞活化和抑制性受体的表达情况,酒精摄入c NK细胞表面ly49家族的表达明显低于对照组,酒精组Lr NK细胞ly49I和ly49H的表达水平明显低于对照组。另外,酒精组c NK细胞表面PD-1和LAG-3明显高于对照组,而Lr NK细胞表面抑制性受体的表达无明显差异。结论c NK细胞在酒精诱导的肝脂肪变性中起保护作用,增加c NK细胞能够明显改善酒精诱导的肝脂肪变性。酒精诱导的肝损伤机制可能与缺乏c NK细胞导致细胞表面受体的表达改变和炎性细胞因子的聚集有关。