真菌免疫调节蛋白表达调控研究

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真菌免疫调节蛋白(fugalimmunomodulatoryproteins,FIPs)一类具有免疫调节活性的小分子蛋白质,主要从高等担子菌中分离出来的。目前已经从多种高等担子菌中分离得到天然FIP蛋白质以及克隆得到他们的基因序列。真菌免疫调节蛋白具有广泛的免疫生物学活性,包括促进淋巴细胞的增殖,调控细胞周期,诱发细胞凋亡,影响细胞因子的表达,活化细胞粘附分子,抗过敏反应等,这些功能使FIPs成为蛋白质药物研究开发中重要一员。本论文从以下两个方面初步探讨了真菌免疫调节蛋白表达调控方式:1.真菌免疫调节蛋白基因启动子的克隆、表达调控元件的预测和鉴定本论文利用同源克隆的方法,从黑灵芝(Ganodermaastum)克隆到了真菌免疫调节蛋白基因FIP-gas,该基因包含336bp,可编码111个氨基酸残基,命名为FIP-gas。FIP-gas分子量为12.4kDa,等电点为4.80,符合FIPs的特性,是FIPs家族一新成员;用生物信息学方法对其进行了系统的预测与分析,结果显示克隆到FIP-gas氨基酸序列与紫芝FIP-gsi和FIP-gja的序列同源性最高,分别为99%、98%,说明克隆到的FIP-gas属于真菌免疫调节蛋白基因。在此基础上,通过基因组步移技术从黑灵芝和赤芝(G.lucidum)中克隆到了真菌免疫调节蛋白基因的启动子,利用生物信息学方法进行了表达调控元件的预测。并且将这两个序列分别克隆到植物表达载体pCAMBIA1304中,利用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105转化进拟南芥,为进一步研究这两种启动子在植物中的表达特性打下了基础。2.真菌免疫调节蛋白基因的诱导表达分析本实验选用黑灵芝和赤芝菌丝体为材料,采用RT-qPCR技术,分析了在灵芝培养环境的pH变化和不同诱导剂水杨酸SA和甲基茉莉酸MeJA诱导情况下,其中培养基pH分别为4.0、5.5、7.0、8.5、10;水杨酸SA浓度为0mg/L、10mg/L、50mg/L、100mg/L、500mg/L和1000mg/L;甲基茉莉酸MeJA浓度分别为0μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、500μmol/L和1000μmol/L,在这些条件下真菌免疫调节蛋白基因的诱导表达特性,结果显示:用MeJA500μmol/L处理后FIP-gas表达量最高,MeJA500μmol/L条件下FIP-glu表达量达到最高;FIP-gas基因在SA10mg/L,FIP-glu基因在SA1000mg/L表达量达到最高值;而在不同pH诱导条件下,两种基因均在pH=10培养条件下,表达量最高。
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