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自2003年起,高致病性H5N1亚型流感病毒感染人的事件不断发生,并且衍生出新的基因谱系,其中,2.3.2.1和2.3.4谱系流行最为广泛。高致病性H5N1病毒存在大规模流行的可能性是被大家所公认的,需要对存在流行风险的多个谱系禽流感病毒进行疫苗的研究。目前广泛应用的灭活疫苗只能针对同谱系病毒感染提供免疫保护,利用杆状病毒表达系统生产的无感染性的病毒样颗粒疫苗,因生产成本低、无生物安全风险等优势受到广泛关注,特别是因其具有诱导细胞免疫能力可能针对同型的异源病毒提供免疫保护,而可能用于变异频繁的流感病毒疫苗研究。本研究的目的是应用昆虫杆状病毒表达系统,通过表达模式筛选、佐剂效应蛋白偶联等系列优化研究,研制H5N1病毒样颗粒,并评估对异源病毒感染的免疫保护作用。首先,利用昆虫杆状病毒表达系统研制了包含H5N1 A/meerkat/Shanghai/SH-1 2012 (clade 2.3.2.1) HA、NA和M1蛋白的病毒样颗粒。通过系列试验鉴定证明,包含HA、NA和M1蛋白的H5N1病毒样颗粒与天然流感病毒具有相似的形态结构和大小,并且具有血凝活性。与全病毒灭活疫苗相比,小鼠通过免疫病毒样颗粒疫苗能够诱导产生更强的体液免疫和细胞免疫,在加强免疫后,可以产生针对A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012特异性IgG,其滴度为全病毒灭活组的20倍。接下来的攻毒结果表明,全病毒灭活组表现出对同源病毒80%的保护率,对异源病毒(A/duck/Jilin/JL-SIV/2013, clade 2.3.4)的保护率只有40%,而病毒样颗粒免疫组小鼠则完全存活,保护率均达到100%。结果显示,流感病毒样颗粒疫苗可以作为一种具有交叉保护活性的流感疫苗能够控制高致病H5N1流感病毒的爆发。为进一步提高病毒样颗粒的免疫原性,我们在疫苗中增加具有免疫佐剂活性的蛋白以期增强疫苗诱导的适应性免疫反应水平。以膜锚定形式构建了包含大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基(LTB),鞭毛蛋白(Toll样受体5的配体,Flic)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的嵌合病毒样颗粒。鉴定表明,LTB-、Flic-和GM-CSF-VLPs病毒样颗粒包含所特有的蛋白,与天然流感病毒具有相似的形态结构和大小,并且具有血凝活性。与未偶联免疫刺激蛋白病毒样颗粒疫苗相比,LTB-、 Flic-和GM-CSF-VLPs病毒样颗粒疫苗能够诱导产生更强的体液免疫和细胞免疫。所有肌肉注射和滴鼻免疫组小鼠均能够保护同源和异源H5N1流感病毒的攻击,然而在口服免疫组中LTB-VLPs、Flic-VLPs或GM-CSF-VLPs能够对同源和异源H5N1流感病毒的攻击提供部分的保护活性,而单独VLPs组则不能保护流感病毒的攻击。LTB-或Flic-VLPs口服免疫组诱导产生比单独VLPs组高10倍的病毒特异性IgG抗体。说明具有免疫刺激活性的LTB-、Flic-和GM-CSF嵌合病毒样颗粒能够诱导产生更强的免疫反应。我们的研究结果表明,基于昆虫杆状病毒表达系统的流感病毒样颗粒可为同源甚至是抗原性存在差异的流感病毒感染提供免疫保护,偶联了具有免疫刺激活性的LTB-VLPs、Flic-VLPs或GM-CSF-VLPs可进一步提高病毒样颗粒的免疫原性。本研究为研发能够控制高致病H5N1亚型禽流感流感病毒流行具有交叉保护活性的疫苗奠定了基础,同时也为新型疫苗研究提供了可借鉴的数据与经验。