酶解罗非鱼皮胶原蛋白制备抗冻多肽及其活性改良的初步研究

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水产品在低温条件下发生蛋白质冷冻变性,出现汁液流失,营养成分含量及风味下降的问题。传统的抗冻剂中的多聚磷酸盐在人体内蓄积易造成钙磷失衡,糖类的添加会一定程度上影响产品风味,研发新型无磷抗冻剂有着重要的应用前景,目前研究得到的抗冻多肽存在产率低、成本高的问题。本研究以罗非鱼皮胶原蛋白为原料,以水解度(DH)为指标对胶原蛋白进行酶解工艺优化,对所得到的多肽进行抗冻活性评价,并对其进行分离纯化以获得高抗冻活性的多肽片段,探究超分子组装是否可以优化胶原蛋白抗冻多肽活性,旨在为研发一种高抗冻活性的多肽类新型抗冻剂提供理论依据。主要研究内容及结果如下:(1)采用热水法提取罗非鱼皮中的胶原蛋白,以水解度为指标对胶原蛋白酶解工艺进行优化。提取得到的胶原蛋白具有纯度高、符合Ⅰ型胶原蛋白的特点,其氨基酸组成中亲水性氨基酸占33.28%。风味蛋白酶最佳酶解条件为:p H 7、加酶量5000 U/g、酶解温度50℃、底物浓度为40 mg/m L、酶解6 h,水解度为22.15%。碱性蛋白酶最佳酶解条件为:底物浓度为20 mg/m L、酶解温度60℃、加酶量5000 U/g、p H 7及酶解3 h,水解度为12.03%。风味蛋白酶酶解产物中相对分子质量小于5 k Da的组分占总酶解产物的57.81%,相对分子量在2.5~5k Da的占22.70%;碱性蛋白酶酶解产物中相对分子量小于2.5 k Da的比重57.01%;风味蛋白酶酶解产物中亲水性氨基酸占38.88%,碱性蛋白酶酶解产物中亲水性氨基酸占38.25%。(2)综合热滞活性、冻藏过氧化氢酶残余活力变化及华贵栉孔扇贝闭壳肌冻藏生化、组织结构变化对胶原蛋白多肽进行抗冻活性评价。胶原蛋白多肽及含磷抗冻剂对过氧化氢酶具有冻藏保护作用,多肽浓度越高抗冻效果越好。胶原蛋白多肽溶液中冰晶含量与热滞活性(THA)成反比关系,冰晶含量越低,THA越大。胶原蛋白碱性蛋白酶酶解产物的THA高于风味蛋白酶酶解产物。扇贝闭壳肌冻藏后发生冷冻变性,与空白对照组相比,胶原蛋白多肽可抑制冻藏后扇贝闭壳肌解冻失水率的增加,盐溶性蛋白含量、总巯基含量及Ca2+-ATPase酶活力的降低的现象,其作用效果与添加量呈正相关性,添加量3%表现出的作用效果与商业含磷抗冻剂相当。添加含磷抗冻剂及胶原蛋白多肽可以保护扇贝闭壳肌冻藏后组织结构完整性。(3)利用Sephadex G-25凝胶柱层析和C18反相高效液相色谱对胶原蛋白多肽进行分离纯化及抗冻活性评价。得到具有高抗冻活性的组分GF24相对分子量在731.34 Da,氨基酸序列为PGDGDSA;GA33分子量在454.26 Da,GA33组分氨基酸序列为NHGK。氨基酸序列中亲水性氨基酸越多抗冻活性越大。(4)胶原蛋白多肽与脯氨酸及甘氨酸在不同蛋白酶作用下进行超分子组装,评价组装产物抗冻活性。GF各处理组游离氨基酸含量增加,胰蛋白酶与木瓜蛋白酶处理组在分子量为0.1~5 k Da范围比重增加,过氧化氢酶残余活力降低,胰蛋白酶及木瓜蛋白酶THA略有上升。GA添加木瓜蛋白酶与胰蛋白酶组装后游离氨基酸含量下降,过氧化氢酶残余活力增加,THA上升。胶原蛋白多肽与甘氨酸在胰蛋白酶及木瓜蛋白酶作用下可以发生超分子组装,小分子多肽比重增加可以提高胶原蛋白多肽抗冻活性。
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