研究背景：甲基苯丙胺又称去氧麻黄碱、甲基安非他明,其盐酸盐为透明的结晶体,结晶状似冰样,在我国俗称“冰毒”,是最常见的新型毒品之一。甲基苯丙胺具有较强的中枢神经兴奋性、致幻、食欲抑制和拟交感能效应。其依赖性较强,可以一次成瘾,剂量大时可出现中毒和死亡。随着甲基苯丙胺的滥用,使用者并发心血管疾病,如心律失常、心肌缺血、夹层动脉瘤、高血压,甚至肥厚性心肌病、急性冠脉综合症、充血性心力衰竭猝死的例子也屡见不鲜。甲基苯丙胺对心血管系统的毒性作用可能是多数甲基苯丙胺滥用者导致死亡的原因。因此,甲基苯丙胺对心血管毒性作用的研究正逐渐成为相关领域的热点和重点。到目前为止,甲基苯丙胺诱导急性心肌梗塞已被广泛报道。在心脏功能衰竭的过程中,心肌细胞凋亡起了关键作用。终末期心肌病患者,可以观察到由于心肌细胞凋亡,导致心肌细胞减少,发展到心脏功能障碍,最终导致心脏功能衰竭。这个提醒我们,甲基苯丙胺很有可能通过相关途径,诱导心肌细胞凋亡,最终引起严重的心脏相关疾病而导致其服用者的死亡。L-型钙离子通道(LTCCs)是细胞外Ca2+进入细胞的重要门户,是心肌兴奋-收缩偶联的重要结构,ICa-L在心肌细胞动作电位形成中具有重要作用。构成心肌细胞LTCCs的重要亚单位有α1c、β2、α2/δ,相关调控蛋白亚基RyR2, SERCA2a和NCX各亚单位的表达改变与ICa-L的改变相关。临床报道,对使用甲基苯丙胺后发生心血管异常症状的患者使用地高辛、钙离子通道阻滞剂,有缓解症状、改善心血管功能的作用。说明甲基苯丙胺可能导致钙通道相关蛋白功能和表达的改变,这些改变参与甲基苯丙胺引起的心血管损伤,其在甲基苯丙胺导致的心律失常过程中可能起着重要作用。本实验以体外、体内两种实验手段,研究甲基苯丙胺是否可以引起细胞凋亡?如何激活细胞调亡途径?是否可以影响心室肌钙电流相关蛋白功能和表达?以探讨甲基苯丙胺对心脏毒性的作用,特别是导致室性心律失常发生的机制。目的：通过在体外环境构建甲基苯丙胺染毒原代培养新生大鼠心室肌细胞毒性模型,了解甲基苯丙胺对心室肌细胞的直接损伤作用,对心室肌细胞凋亡的影响和对钙离子通道相关蛋白的表达及功能影响,探讨甲基苯丙胺影响钙离子电流相关蛋白的功能与表达最终导致室性心律失常发生的分子机制和电生理机制。通过在体内环境分别构建甲基苯丙胺急性染毒大鼠心室肌毒性模型,验证体外环境甲基苯丙胺对原代培养新生大鼠心室肌细胞毒性作用；分别建立甲基苯丙胺急性染毒大鼠及停药不同时间的恢复模型。探讨由甲基苯丙胺所引起的心室肌病理性损伤及分子水平损伤的可恢复能力和停止染毒后不同时间的恢复能力。方法：本实验分成两个大部分,分别从体外与体内两个方向对甲基苯丙胺引起的心室肌毒性进行研究。一、甲基苯丙胺对原代培养新生大鼠心室肌细胞毒性研究1、甲基苯丙胺导致原代培养新生大鼠心室肌细胞凋亡。(1)出生1天内的SD乳鼠,雌雄不拘,心室肌细胞分离及原代培养,将培养72h已呈规律搏动的心室肌细胞随机分为四组,弃去培养基,Hank’s液轻柔洗涤一次,按照0.5/1.0/1.5mM浓度分别给予含有相应浓度甲基苯丙胺的D-MEM液,并设立对照组,一并放入C02培养箱内继续培养。(2)甲基苯丙胺染毒后对心室肌细胞进行形态学观察。(3)甲基苯丙胺染毒后心室肌细胞TUNEL凋亡检测,观察甲基苯丙胺对心室肌细胞的毒性作用。2、甲基苯丙胺导致原代培养新生大鼠心室肌细胞凋亡机制研究(1)实时荧光定量PCR技术及Western Blot技术：检测甲基苯丙胺作用原代培养新生大鼠心室肌细胞IGFBP5基因和蛋白表达。(2)RNA干扰(RNAi)技术：沉默IGFBP5基因后原代培养新生大鼠心室肌细胞IGFBP5的蛋白表达。(3) TUNEL凋亡检测技术：检测沉默IGFBP5基因后甲基苯丙胺作用原代培养新生大鼠心室肌细胞的凋亡情况。(4) Western Blot技术：检测沉默IGFBP5对甲基苯丙胺引起的心室肌细胞caspase-3蛋白表达变化的影响。3、甲基苯丙胺对原代培养新生大鼠心室肌离子调控蛋白影响(1)实时荧光定量PCR技术：检测甲基苯丙胺作用原代培养新生大鼠心室肌细胞LTCC α1c、β2、SERCA2a、NCX和RyR2基因表达水平。(2) Western Blot技术：检测甲基苯丙胺作用原代培养新生大鼠心室肌细胞LTCC α1c、β2、SERCA2a、NCX和RyR2蛋白表达水平。二、甲基苯丙胺对大鼠心室肌毒性研究1、急性组与其停药组甲基苯丙胺中毒大鼠模型建立(1)急性组(AM组)：200-220g SD雄性大鼠10只,单笼饲养于空调恒温26℃,昼夜循环(昼14h/天)动物房,自由进食饮水,适应一周后5mg/Kg甲基苯丙胺生理盐水溶液,两次/日(8AM及8PM各一次),连续给药十四次(七天)。建模成功24小时内心脏取材。(2)急性停药组(AW组)：200-220g SD雄性大鼠40只,随机分成AW1、AW2、AW4和AW8四组,每组10只,单笼饲养于空调恒温26℃,昼夜循环(昼14h/天)动物房,自由进食饮水,适应一周后5mg/Kg甲基苯丙胺生理盐水溶液,两次/日(8AM及8PM各一次),连续给药一周,一周后停药喂养一周、二周、四周、八周,建模成功24小时内心脏取材。(3)急性对照组(AC组)：200-220g SD雄性大鼠10只,将甲基苯丙胺生理盐水溶液换为等量生理盐水溶液,余处理同急性中毒组,建模成功24小时内心脏取材。2、急性组与其停药组甲基苯丙胺中毒大鼠心室肌病理学研究将取材样本放入4%中性甲醛缓冲液中室温固定24h,常规脱水,石蜡包埋,切片,做HE染色。镜下观察心室肌形态学改变,比较各组大鼠心室肌病理改变情况。3、甲基苯丙胺对急性组与其停药组大鼠心室肌通道蛋白影响(1)实时荧光定量PCR技术：检测甲基苯丙胺作用急性组与其停药组大鼠LTCCα1c,β2基因表达水平。(2) Western Blot技术：检测甲基苯丙胺作用急性组与其停药组大鼠LTCC α1c,β2蛋白表达水平。结果：一、甲基苯丙胺对原代培养新生大鼠心室肌细胞毒性研究1、心室肌细胞形态学变化原代培养新生大鼠心室肌细胞24-48h,细胞互相接触形成细胞簇,搏动同步化,频率在70-90次/分,搏动细胞超过95%。甲基苯丙胺给药0-24h观察,0.5mM组细胞形态未见明显变化,细胞搏动加快。48-72h,细胞搏动渐恢复至70-90次/分,搏动较规则,少数出现变圆、扁梭、折光性加强等病变。1.OmM组细胞形态未见明显变化,细胞搏动加快。48-72h,细胞搏动渐平复并明显减慢为50-70次/分,搏动不规则,细胞出现变圆、扁梭、折光性加强等明显病变,随着时间延长,细胞损伤加重,最终停止搏动,自皿上脱落、死亡。1.5mM组细胞与1.0mM组相比更严重。2、TUNEL法检测甲基苯丙胺作用后原代培养新生大鼠心室肌细胞的凋亡TUNEL法检测甲基苯丙胺作用后原代培养新生大鼠心室肌细胞的凋亡率随甲基苯丙胺浓度增加逐渐升高,对照组未见心肌细胞发生凋亡；0.5mmol/L浓度组(凋亡率为5.01±0.225%)及1.0mmol/L浓度组(凋亡率为7.50±0.340%)开始出现凋亡细胞,散在分布,无明显特点；1.5mmol/L浓度组(凋亡率为31.43±0.896%)心肌细胞发生明显凋亡。0.5mmol/L、1. Ommol/L、1.5mmol/L浓度组与对照组相比凋亡率均有显著性差异(P<0.01)。3、甲基苯丙胺导致原代培养新生大鼠心室肌细胞凋亡机制研究甲基苯丙胺作用后原代培养新生大鼠心室肌细胞,对照组(相对表达量为1.00±0.010)IGFBP5基因表达相对较低；0.5mmol/L浓度组(相对表达量为1.53±0.126)及1.0mmol/L浓度组(相对表达量为1.98±0.140)开始出现表达上调,但不明显；1.5mmol/L浓度组(相对表达量为4.67±0.210)心室肌细胞IGFBP5基因表达明显上调。0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L浓度组与对照组相比相对表达量均有显著性差异(P<0.01)。对照组(相对表达量为1.00±0.010)IGFBP5基因的蛋白水平表达相对较低；0.5mmol/L浓度组(相对表达量为1.98±0.035)及1.0mmol/L浓度组(相对表达量为1.98±0.035)开始出现表达上调,但不明显；1.5mmol/L浓度组(相对表达量为1.98±0.035)心室肌细胞IGFBP5基因的蛋白水平表达明显上调。0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L浓度组与对照组相比相对表达量均有显著性差异(P<0.01)。TUNEL法检测沉默IGFBP5基因后1.5mM甲基苯丙胺作用原代培养新生大鼠心室肌细胞的凋亡。0mM+siNC组为非特异性的小干扰RNA序列并且没有甲基苯丙胺作用的对照组,对照组未见心肌细胞发生凋亡：与1.5mM+siNC组(凋亡率为10.00±0.403)相比,1.5mM+siIGFBP5-1组(凋亡率为5.90±0.986)和1.5mM+siIGFBP5-2组(凋亡率为4.33±0.872)P<0.05,差异有统计学意义,沉默IGFBP5基因后1.5mM甲基苯丙胺作用原代培养新生大鼠心室肌细胞,其凋亡率明显下降,有统计学意义。4、甲基苯丙胺对原代培养新生大鼠心室肌离子调控蛋白影响我们观察到甲基苯丙胺可以抑制了原代培养新生大鼠心室肌L型钙离子通道α1c,β2亚基的基因(α1c:Con为1.003±0.009,MA为0.469±0.021；β2：Con为1.003±0.006,MA为0.455±0.032)及蛋白(α1c:Con为1.000±0.000,MA为0.228±0.027；β2：Con为1.000±0.000,MA为0.545±0.037)表达水平,同时上调钙离子相关调控蛋白SERCA2a, NCX和RyR2的基因(SERCA2a:Con为0.999±0.0.002,MA为2.244±0.052; NCX: Con为1.001±0.002,MA为1.894±0.038；RyR2:Con为1.001±0.002,MA为3.033±0.111)及蛋白(SERCA2a:Con为1.000±0.000,MA为2.124±0.044；NCX:Con为1.000±0.000,MA为1.653±0.034; RyR2:Con为1.000±0.000,MA为2.875±0.059)表达水平。差异有统计学意义(P<0.01)。二、甲基苯丙胺对大鼠心室肌毒性研究1、急性组与其停药组甲基苯丙胺中毒大鼠心室肌病理学研究急性组大鼠心室肌细胞HE染色可见波浪样变、颗粒样变、收缩带坏死、小梗死灶形成、间质出血、心肌细胞断裂、嗜酸性增强,局灶性心肌间质纤维增多、少许炎细胞浸润,对照组大鼠心肌细胞平滑,未见淤血、水肿等改变。急性停药组大鼠心室肌细胞HE染色可见,在停药一周后,严重的病理改变开始恢复,在停药两周后,病理改变进一步恢复,四周之后开始出现肉芽组织,纤维化形成。2、甲基苯丙胺对急性组与其停药组大鼠心室肌通道蛋白影响对于CACNA1C基因及CACNB2基因,与对照组S1组相比急性组M1组表达明显下降,P<0.05,差异有统计学意义。与急性组M1组相比W1组表达无明显变化,P>0.05,差异没有统计学意义。与急性组M1组相比W2组表达无明显变化,P>0.05,差异没有统计学意义。与急性组M1组相比W4组表达表达开始上调,P<0.05,差异有统计学意义,与急性组M1组相比W8组表达表达开始上调,P<0.05,差异有统计学意义。甲基苯丙胺给药后心室肌内钙离子调控相关蛋白的mRNA水平及蛋白水平表达的下降,其中CACNAIC的mRNA表达下降44%,蛋白表达下降41%,CACNB2的mRNA表达下降67%,蛋白表达下降55%。其中CACNAIC在甲基苯丙胺停药后一周及两周,mRNA表达及蛋白表达均未发生明显变化,在甲基苯丙胺停药四周后,mRNA表达恢复33%,蛋白表达恢复55%,在甲基苯丙胺停药八周后,mRNA表达恢复64%,蛋白表达恢复66%。其中CACNB2在甲基苯丙胺停药后一周及两周,mRNA表达及蛋白表达均未发生明显变化,在甲基苯丙胺停药四周后,mRNA表达恢复68%,蛋白表达恢复44%,在甲基苯丙胺停药八周后,mRNA表达恢复93%,蛋白表达恢复94%。结论：甲基苯丙胺可以直接导致心室肌细胞的损伤而不通过神经、体液的调节,且心室肌细胞损伤及变化的严重程度与给药浓度呈正比。甲基苯丙胺通过上调IGFBP5,进而激活了半胱氨酸蛋白酶-3途径,最终诱导心室肌细胞发生凋亡,是半胱氨酸蛋白酶-3依赖通路介导的细胞凋亡。甲基苯丙胺通过影响心室肌细胞钙循环通路蛋白LTCCa亚基(CACNAIC),β2亚基(CACNB2), RyR2, SERCA2a和NCX及基因表达,干扰细胞内钙离子平衡,直接抑制了心脏收缩功能,心肌传导速度下降,是一个导致心律失常的危险因素。在动物实验,甲基苯丙胺可以影响钙离子通道的主要亚基CACNA1C,、CACNB2,进而影响L型钙离子电流,其可能是甲基苯丙胺诱发心律失常的关键因素。这种影响可以在停止用药一个月后得到恢复,但是不同基因其恢复能力不同,其中CACNA1C恢复能力较差,其可能是甲基苯丙胺诱导心脏损伤的康复期晚期心律失常发生的一个可能的诱导因素。