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目的：
设计、制备可干预黑色素合成的新型纳米核酸制剂，并研究其对黑色素瘤A375细胞酪氨酸酶基因表达、细胞增殖及凋亡的影响。
方法：
1．设计针对酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）靶点的siRNA，通过实时荧光定量PCR筛选出抑制TYRmRNA效果最好的siRNA，用蛋白质免疫印迹法进一步分析TYR-siRNA对TYR蛋白表达的影响。
2．通过实时荧光定量PCR检测TYRmRNA相对表达水平，通过流式细胞仪检测凋亡率和细胞周期，比较不同浓度的TYR-siRNA、小眼畸形相关转录因子MITF（Microphthalmia-associatedtranscriptionfactors）-siRNA对TYRmRNA的相对表达水平及其对A375细胞凋亡、周期的影响。
3．选出最佳靶点和最佳浓度的siRNA，制备纳米核酸制剂。通过激光共聚焦显微镜观察A375细胞对纳米核酸制剂的摄取情况。
4．运用实时荧光定量PCR检测纳米核酸制剂对A375细胞TYRmRNA的相对表达水平，运用MTT法、DAPI染色法、流式细胞仪检测法研究纳米核酸制剂对A375细胞增殖、形态学变化和凋亡的影响。
5．采用单因素方差分析对结果统计分析。结果：
1．实时荧光定量PCR筛选出siRNA-2为干扰TYRmRNA效果最好的siRNA，同时蛋白质免疫印迹法验证其在蛋白水平上同样抑制TYR的表达（P<0.05）。
2．TYRmRNA表达量与TYR-siRNA浓度存在剂量依赖效应，随siRNA浓度增大而降低（P<0.05），细胞凋亡率与TYR-siRNA浓度存在剂量依赖效应，随浓度增加而增大（P<0.05）。
3．TYR-siRNA阻滞细胞周期的S期，存在浓度依赖效应（P<0.05）。
4．TYRmRNA表达量和MITFmRNA表达量与MITF-siRNA浓度存在剂量依赖效应，随siRNA浓度增大而降低（P<0.05），细胞凋亡率与MITF-siRNA浓度存在剂量依赖效应，随浓度增加而增大（P<0.05）。
5．MITF-siRNA阻滞细胞周期的G0/G1期，存在浓度依赖效应（P<0.05）
6．激光共聚焦显微镜观察纳米核酸制剂能被A375细胞摄取。
7．纳米核酸制剂干预A375细胞后，TYRmRNA相对表达量降低（P<0.05），细胞增殖率降低（P<0.05），激光共聚焦显微镜观察发现细胞核形态发生改变，能促进细胞凋亡（P<0.05）。
结论：
1．TYR-siRNA和MITF-siRNA均能有效抑制黑色素合成的关键酶TYR的mRNA表达，并能诱导黑色素瘤A375细胞凋亡。
2．TYR-siRNA和MITF-siRNA对细胞周期的影响不同，siRNA达到300pmol时，尤其是MITF-siRNA，细胞出现异常增殖，因此确定TYR为作用靶点。由于剂量依赖效应，选用200pmol浓度制备纳米核酸制剂。
3．本研究制备的纳米核酸制剂可以被黑色素瘤A375细胞摄取。
4．纳米核酸制剂能抑制TYRmRNA表达，抑制细胞增殖，使细胞核形态皱缩、产生异染色质，从而促进细胞的凋亡。
5．纤维状纳米核酸制剂较球状纳米核酸制剂转染siRNA的效率更高，更能有效抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。
设计、制备可干预黑色素合成的新型纳米核酸制剂，并研究其对黑色素瘤A375细胞酪氨酸酶基因表达、细胞增殖及凋亡的影响。
方法：
1．设计针对酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）靶点的siRNA，通过实时荧光定量PCR筛选出抑制TYRmRNA效果最好的siRNA，用蛋白质免疫印迹法进一步分析TYR-siRNA对TYR蛋白表达的影响。
2．通过实时荧光定量PCR检测TYRmRNA相对表达水平，通过流式细胞仪检测凋亡率和细胞周期，比较不同浓度的TYR-siRNA、小眼畸形相关转录因子MITF（Microphthalmia-associatedtranscriptionfactors）-siRNA对TYRmRNA的相对表达水平及其对A375细胞凋亡、周期的影响。
3．选出最佳靶点和最佳浓度的siRNA，制备纳米核酸制剂。通过激光共聚焦显微镜观察A375细胞对纳米核酸制剂的摄取情况。
4．运用实时荧光定量PCR检测纳米核酸制剂对A375细胞TYRmRNA的相对表达水平，运用MTT法、DAPI染色法、流式细胞仪检测法研究纳米核酸制剂对A375细胞增殖、形态学变化和凋亡的影响。
5．采用单因素方差分析对结果统计分析。结果：
1．实时荧光定量PCR筛选出siRNA-2为干扰TYRmRNA效果最好的siRNA，同时蛋白质免疫印迹法验证其在蛋白水平上同样抑制TYR的表达（P<0.05）。
2．TYRmRNA表达量与TYR-siRNA浓度存在剂量依赖效应，随siRNA浓度增大而降低（P<0.05），细胞凋亡率与TYR-siRNA浓度存在剂量依赖效应，随浓度增加而增大（P<0.05）。
3．TYR-siRNA阻滞细胞周期的S期，存在浓度依赖效应（P<0.05）。
4．TYRmRNA表达量和MITFmRNA表达量与MITF-siRNA浓度存在剂量依赖效应，随siRNA浓度增大而降低（P<0.05），细胞凋亡率与MITF-siRNA浓度存在剂量依赖效应，随浓度增加而增大（P<0.05）。
5．MITF-siRNA阻滞细胞周期的G0/G1期，存在浓度依赖效应（P<0.05）
6．激光共聚焦显微镜观察纳米核酸制剂能被A375细胞摄取。
7．纳米核酸制剂干预A375细胞后，TYRmRNA相对表达量降低（P<0.05），细胞增殖率降低（P<0.05），激光共聚焦显微镜观察发现细胞核形态发生改变，能促进细胞凋亡（P<0.05）。
结论：
1．TYR-siRNA和MITF-siRNA均能有效抑制黑色素合成的关键酶TYR的mRNA表达，并能诱导黑色素瘤A375细胞凋亡。
2．TYR-siRNA和MITF-siRNA对细胞周期的影响不同，siRNA达到300pmol时，尤其是MITF-siRNA，细胞出现异常增殖，因此确定TYR为作用靶点。由于剂量依赖效应，选用200pmol浓度制备纳米核酸制剂。
3．本研究制备的纳米核酸制剂可以被黑色素瘤A375细胞摄取。
4．纳米核酸制剂能抑制TYRmRNA表达，抑制细胞增殖，使细胞核形态皱缩、产生异染色质，从而促进细胞的凋亡。
5．纤维状纳米核酸制剂较球状纳米核酸制剂转染siRNA的效率更高，更能有效抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。