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目的:基于m TOR/ULK1/ATG13信号通路调控自噬、c AMP/PKA信号通路调控泛素化修饰,探讨隔药灸对克罗恩病大鼠结肠NLRP3炎症小体活化的调节机制,阐释隔药灸改善克罗恩病肠道炎症、恢复肠道稳态的作用机制。方法:采用TNBS合50%乙醇溶液灌肠制备大鼠CD模型。(1)第一部分:隔药灸通过自噬途径调控克罗恩病NLRP3炎症小体的表达SD大鼠随机分为正常组、模型组、隔药灸组和自噬抑制剂组。模型制备成功后,隔药灸组选取“天枢”(双侧)穴、“气海”穴隔药灸干预,自噬抑制剂组选用自噬抑制剂3-MA腹腔注射。干预结束后,采用HE染色和透射电镜观察大鼠结肠组织形态学变化、超微结构及自噬体,采用Western blot技术检测结肠NLRP3、IL-1β、LC3II、P62、Beclin-1的蛋白表达。(2)第二部分:基于m TOR/ULK1/ATG13信号通路研究隔药灸通过自噬调控克罗恩病NLRP3炎症小体的作用机制SD大鼠随机分为正常组、模型组、隔药灸组、m TOR抑制剂组和m TOR抑制剂+隔药灸组。m TOR抑制剂组选用m TOR抑制剂雷帕霉素腹腔注射;m TOR抑制剂+隔药灸组在腹腔注射m TOR抑制剂雷帕霉素的同时进行隔药灸干预。干预结束后,HE染色观察大鼠结肠组织形态学变化,采用Western blot技术检测结肠NLRP3、IL-1β、LC3II、Beclin-1、m TOR、p-m TOR、ULK1、p-ULK1、ATG13、p-ATG13的蛋白表达,应用RT-q PCR技术检测m TOR、ULK1、ATG13的m RNA表达。(3)第三部分:基于c AMP/PKA信号通路研究隔药灸通过泛素化修饰途径调控克罗恩病NLRP3炎症小体的作用机制SD大鼠随机分正常组、模型组、隔药灸组和c AMP激动剂组。模型制备成功后,c AMP激动剂组选用c AMP激动剂Forskolin腹腔注射。干预结束后,HE染色观察大鼠结肠组织形态学变化,应用ELISA技术检测结肠c AMP的蛋白浓度,采用Western blot技术检测结肠PKA、Ub、NLRP3、IL-1β的蛋白表达,应用免疫荧光双标法检测结肠NLRP3与泛素蛋白Ub共表达的情况。结果:(1)第一部分:与正常组比较,模型组大鼠结肠CMDI评分和病理学评分均明显升高(均P<0.01);与模型组比较,隔药灸组、自噬抑制剂组大鼠结肠CMDI评分和病理学评分均明显降低(均P<0.05)。形态学观察结果正常组大鼠结肠上皮细胞排列整齐,结构完整,腺体排列整齐,偶见炎症细胞;模型组大鼠结肠上皮损伤明显,严重者可见上皮脱落,杯状细胞大量增生,线粒体损伤,可观察到典型的自噬泡;隔药灸组、自噬抑制剂组大鼠结肠可见新生的黏膜上皮修复,腺体排列较规则,溃疡有愈合倾向,细胞器肿胀、变形减轻,自噬泡结构不典型。与正常组比较,模型组大鼠结肠组织中NLRP3、IL-1β、LC3II、Beclin-1蛋白表达均明显升高(均P<0.05);与模型组比较,隔药灸组、自噬抑制剂组大鼠结肠组织中NLRP3、IL-1β、LC3II、Beclin-1蛋白表达均明显降低(均P<0.05)。(2)第二部分:与正常组比较,模型组、m TOR抑制剂组大鼠结肠病理学评分均明显升高(均P<0.01);与模型组比较,隔药灸组大鼠结肠病理学评分均明显降低(P<0.05);与隔药灸组比较,m TOR抑制剂+隔药灸组大鼠结肠病理学评分明显升高(P<0.01)。与正常组比较,模型组、m TOR抑制剂组大鼠结肠组织中NLRP3、IL-1β、LC3II、Beclin-1蛋白表达均明显升高(均P<0.01),m TOR、p-m TOR蛋白及m RNA表达均明显降低(均P<0.01),ULK1、p-ULK1、ATG13、p-ATG13蛋白及m RNA表达均明显升高(均P<0.05);与模型组比较,隔药灸组大鼠结肠组织中NLRP3、IL-1β、LC3II、Beclin-1蛋白表达均明显降低(P<0.05),p-m TOR蛋白及m RNA表达均明显升高(P<0.01),ULK1、p-ULK1、ATG13、p-ATG13蛋白及m RNA表达均明显降低(均P<0.05);与隔药灸组比较,m TOR抑制剂+隔药灸组大鼠结肠组织中NLRP3、IL-1β、LC3II、Beclin-1蛋白表达均明显升高(均P<0.05),m TOR、p-m TOR蛋白及m RNA表达明显均明显降低(均P<0.05),ULK1、p-ULK1、ATG13、p-ATG13蛋白及m RNA表达均明显升高(均P<0.05)。(3)第三部分:与正常组比较,模型组大鼠结肠病理学评分明显升高(P<0.01);与模型组比较,隔药灸组、c AMP激动剂组大鼠结肠病理学评分均明显降低(均P<0.01)。与正常组比较,模型组大鼠结肠组织中c AMP蛋白浓度明显降低(P<0.01);与模型组比较,隔药灸组、c AMP激动剂组大鼠结肠组织中c AMP蛋白浓度明显升高(均P<0.01);与正常组比较,模型组大鼠结肠组织中PKA、Ub蛋白表达明显降低(P<0.05);与模型组比较,隔药灸组、c AMP激动剂组大鼠结肠组织中PKA、Ub蛋白表达均明显升高(均P<0.05)。各组大鼠结肠组织中,均可见NLRP3蛋白与泛素蛋白Ub的阳性表达,两者多表达在黏膜层与黏膜下层,两者共表达阳性反应点呈亮黄色。正常组大鼠结肠组织中NLRP3、泛素蛋白Ub以及两者共表达阳性反应点,数目少,颜色较浅,呈弱阳性;与正常组比较,模型组大鼠结肠组织中NLRP3阳性反应点数目较多、颜色鲜明,泛素蛋白Ub,颜色较暗、呈弱阳性,两者共表达反应点阳性结果不明显;隔药灸组、c AMP激动剂组大鼠结肠组织中NLRP3阳性反应点数目较少、颜色较暗,呈弱阳性,泛素蛋白Ub,颜色鲜明,两者共表达反应点数目较少。与正常组比较,模型组大鼠结肠组织中NLRP3、IL-1β蛋白表达均明显升高(P<0.01);与模型组比较,隔药灸组、c AMP激动剂组大鼠结肠组织中NLRP3、IL-1β蛋白表达均明显降低(P<0.01)。结论:(1)隔药灸能调节克罗恩病大鼠结肠自噬相关蛋白LC3II、Beclin-1的表达,抑制自噬活性,下调NLRP3及其下游炎症因子IL-1β的表达,减轻结肠炎症,促进结肠黏膜损伤的修复。(2)隔药灸能上调克罗恩病大鼠结肠m TOR磷酸化蛋白及m RNA表达,抑制ULK1、ATG13蛋白及m RNA表达;隔药灸可能通过调控m TOR/ULK1/ATG13信号通路抑制结肠自噬活性,进而下调NLRP3、IL-1β的表达,缓解炎症反应,发挥治疗作用。(3)隔药灸能上调克罗恩病大鼠结肠c AMP、PKA蛋白表达;激活c AMP/PKA信号通路,促进泛素蛋白Ub表达以及NLRP3与Ub共表达,进而降低NLRP3及其下游炎症因子IL-1β的表达,可能是隔药灸治疗克罗恩病的作用机制之一。