多倍化是自然界中不断在发生的过程,是物种遗传物质快速增加的捷径,在植物和脊椎动物的进化过程中起到了非常重要的作用。多倍体物种依然存在于现生的很多生物类群中。已有的研究表明鲤科鱼类中的多倍化演化是非常突出的,在鲤形目鲤科的鲤亚科、鲃巴亚科和裂腹鱼亚科中存在着大量不同倍性的物种,为我们提供了理想的模型去研究脊椎动物染色体多倍化后基因和基因组的进化问题。结合已有的相关研究,本研究选择鲤科鱼类中的若干多倍体物种为研究对象,旨在构建多倍体鲤科鱼类基因和基因组演化的研究平台,并探讨多倍体鲤科鱼类基因和基因组的演化规律。因此,本论文的研究内容主要分为三个部分:　　 (一)为了深入研究具有重大养殖价值的经济鱼类和作为适应青藏高原特殊生境鱼类代表的齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)(2n=148),本研究用pCC1BAC/EcoRI载体构建了齐口裂腹鱼基因组细菌人工染色体(bacterialartificial chromosome,BAC)文库。该文库一共含有克隆71808个。随机挑取144个BAC克隆NotI酶酶切结果表明:插入片段为20kb-300kb,平均插入片段长度为110kb,空载率为2.5％,插入片段大于100kb的克隆所占的比率为66.7％,插入片段小于50kb的克隆所占的比率为2.1％。齐口裂腹鱼的单倍体基因组大小为782.4Mb(N=6)或者1564.8Mb(N=3),因此本文库的覆盖率达到齐口裂腹鱼基因组的9.8倍或者4.9倍。理论上,从该文库中找到任意单拷贝序列的概率大于99％。本文库将为齐口裂腹鱼重要经济性状基因的克隆、基因功能的研究、分子标记的开发、物理图谱的构建、比较基因组研究和全基因组测序奠定基础和提供原始材料,将为揭示齐口裂腹鱼的遗传本质作贡献。特别是为研究裂腹鱼类如何通过基因组加倍,在基因组水平上如何适应青藏高原的极端环境提供了研究工具,为研究年轻多倍体鲤科鱼类的基因和基因组演化提供了研究平台。　　 (二)为了研究重要功能基因在年轻多倍体鲤科鱼类基因组中的进化问题,我们以动物发育过程中重要的转录因子Sox和Hox基因为对象,分别研究了它们在鲤科结鱼属鱼类(瓣结鱼、大鳞结鱼、中国结鱼和桥街结鱼)及四倍体金鱼基因组中的演化。　　 我们首先使用细胞色素b基因序列重新构建了结鱼属鱼类的系统进化关系,并重新估计了它们的分化时间。结果显示结鱼属鱼类起源于大约15 MYA,瓣结鱼的分化时间10 MYA,分支(桥街结鱼,(大鳞结鱼,中国结鱼))形成的时间在3-4 MYA。通过PCR和克隆的方法,使用两对引物SoxN和Sox9,在这四种结鱼中一共获得52条Sox基因序列,分别属于SoxB、SoxC、和SoxE组。与预期的一样,Sox基因的拷贝数与结鱼的倍性相一致,如Sox9a基因在二倍体瓣结鱼有一个拷贝,在四倍体的大鳞结鱼和中国结鱼中则有两个不同的拷贝。分析结果表明,重复的Sox基因组在多倍体基因组内是独立进化的。替代速率分析表明不同多倍体内和不同多倍体间,以及多倍体与二倍体间的重复的Sox基因具有相同的非同义突变率,说明在多倍化的早期作为发育过程中重要的转录因子的重复Sox基因,在不同的多倍体结鱼中以及二倍体结鱼中在氨基酸水平上受到相同的选择压力。我们所得到的Sox基因序列没有发现明显的变异增加或者大量的假基因化,说明这些Sox基因序列在DNA水平都是具有功能的。谱系分析的结果显示,未知倍性的桥街结鱼为四倍体,大鳞结鱼、桥街结鱼和中国结鱼为异源四倍体,而瓣结鱼可能是它们的一个二倍体祖先的近缘种。　　 通过实验,我们在四倍体金鱼中共得到32条不同的Hox基因序列,代表了金鱼中13个Hox基因簇。序列分析发现在四倍体金鱼基因组中,已有的49条Hox基因序列中有8条通过非三联体缺失,导致序列发生移码突变而最终形成假基因。分析表明:四倍体金鱼中重复Hox基因对间是独立进化的；相对速率检验表明,四倍体金鱼中重复Hox基因对的进化没有出现速率上的异质性；重复Hox基因对问的Ka/Ks都小于1。说明重复Hox基因对进化上均处于负选择的压力之下；与其斑马鱼中的直系同源基因相比,金鱼中重复Hox基因对间具有几乎相同的Ka,说明金鱼中重复Hox基因对间受到相同的选择压力。　　 (三)当我们从基因组角度研究一个非模式物种时,最开始一般是获得该物种大量的基因或者基因组序列,而目前的新一代测序技术可以替代传统的Sanger测序技术应用到非模式物种的转录组研究中。我们用Solexa测序获得了两种倍性和等级不同裂腹鱼的转录组快照,同时为了对照分析还测序分析了二倍体鳙的转录组快照。在齐口裂腹鱼中得到短序列数目为16,971,960、纳木错裸鲤中17,895,950,鳙中15,963,958。经拼接齐口裂腹鱼中产生93,579个Scaffold,N50为844,平均长度为500bp:纳木错裸鲤中,产生96,125个Scaffold,N50为752,平均长度为463bp；鳙中,产生94,402个Scaffold,N50为600,平均长度为415bp。对所得到的长度大于300bp的Scaffold序列,通过比对,在NR库、COGs库、KEGG库以及Swiss-Prot数据库进行了注释,以及GO(Gene ontology)功能注释。对所鉴定到的直系同源基因分析发现,齐口裂腹鱼和纳木错裸鲤直系同源基因间的遗传距离主要集中在0-0.1之间,具有类似的进化速度；而齐口裂腹鱼和鳙、纳木错裸鲤和鳙直系同源基因间的遗传距离具有相似的分布图,直系同源基因间的遗传距离主要集中在0-0.25和0.5-1之间,说明在裂腹鱼和鳙间直系同源基因按不同速率进化的。通过对相对表达量(REL)的均一化,我们比较了齐口裂腹鱼和纳木错裸鲤、齐口裂腹鱼和鳙、纳木错裸鲤和鳙间REL分布,结果发现裂腹鱼和纳木错裸鲤间REL分布没有差异,而齐口裂腹鱼和鳙、纳木错裸鲤和鳙间REL分布具有显著性差异,同时齐口裂腹鱼和纳木错裸鲤的REL整体上小于鳙的REL,对它们直系同源基因间的REL分析得到同样的结果。推测多倍化做为裂腹鱼适应高原的一种遗传策略,其基因表达量并没有出现与其倍性正相关的变化,而多倍化所形成的大量重复基因作为一种遗传潜质保留在基因组中,当环境出现恶化时为其环境适应提供演化的遗传材料。我们用Solexa测序获得了两种倍性和等级不同裂腹鱼的转录组快照,为今后探讨多倍化在裂腹鱼适应青藏高原过程中的作用、鉴别高原鱼类适应高原极端生境海拔高、辐射强、水温和含氧量低的相关基因或基因组区域提供帮助,也表明新一代测序技术在非模式物种研究中的应用前景。