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油菜是世界上最重要的油料作物之一,但由核盘菌感染引起的菌核病对甘蓝型油菜的生长造成巨大危害,严重影响作物产量。植物先天免疫系统介导的防御反应是甘蓝型油菜抵抗核盘菌入侵的主要途径。BnWRKY33是油菜菌核病抗性的正调控因子,但其作用机制还不是非常清楚。本研究发现BnaA03.WRKY28和BnWRKY33两个转录因子均能结合BnWRKY33启动子,但对甘蓝型油菜菌核病的抗性起到相反的作用。通过分析BnaA03.WRKY28和BnWRKY33受核盘菌感染的诱导表达模式和对BnWRKY33启动子的作用方式,解析了甘蓝型油菜在应答核盘菌感染时由BnaA03.WRKY28和BnWRKY33介导的菌核病抗性机理,以此构建了一条较为完整的油菜菌核病抗性调控、生长和防御达到平衡的信号通路。主要研究结果如下:1.BnaA03.WRKY28生物学功能鉴定。在Jia9709和Westar两种甘蓝型油菜品系中分离到At WRKY28的5个同源拷贝,分别位于A01、C01、A03、A08、C08染色体上,其中位于A03上的拷贝BnaA03.WRKY28受到核盘菌感染诱导表达,其表达量在接种病原菌48 h后达到峰值。构建BnaA03.WRKY28超表达和基因编辑载体,转化Jia9709和Westar两种甘蓝型油菜品系,获得BnaA03.WRKY28超表达和纯合的BnaA03.WRKY28基因编辑遗传转化材料。对BnaA03.WRKY28遗传转化材料和转基因受体材料接种核盘菌,离体叶片接菌试验和茎秆接菌试验都显示BnaA03.WRKY28超表达株系相比野生型植株发病程度严重,而BnaA03.WRKY28基因编辑株系相比野生型植株发病程度轻微,表明BnaA03.WRKY28是甘蓝型油菜菌核病抗性的负调控因子。2.BnaA03.WRKY28调控下游靶基因表达。通过RNA-seq和ChIP-seq分析发现BnWRKY33可能是BnaA03.WRKY28的下游靶基因,并通过ChIP-q PCR、Y1H、双萤光素酶报告分析、EMSA等体内和体外试验证明了BnaA03.WRKY28与BnWRKY33启动子直接结合。进一步的分析发现BnWRKY33启动子区的W1和W3两个W-box是BnaA03.WRKY28的结合位点。BnaA03.WRKY28通过直接结合BnWRKY33的启动子来促进BnWRKY33的表达。BnWRKY33DD是BnWRKY33被磷酸化激活的形式,BnWRKY33DD也能直接结合BnWRKY33启动子并促进BnWRKY33的表达。但BnWRKY33DD的转录活性显著高于BnaA03.WRKY28。3.磷酸化激活BnWRKY33的MAPK级联通路分析。BnaA03.MKK4、BnaA06.MAPK3和Bna C03.MAPK3均受到核盘菌感染诱导表达,试验分析发现:BnaA03.MKK4能与BnaA06.MAPK3和Bna C03.MAPK3发生蛋白相互作用,而BnaA06.MAPK3和Bna C03.MAPK3均能与BnWRKY33发生蛋白相互作用。进一步通过体内双萤光素酶报告分析和体外磷酸化检测发现BnWRKY33是BnaA03.MKK4-BnaA06.MAPK3/Bna C03.MAPK3模块的磷酸化底物,BnWRKY33被磷酸化后,其转录活性显著增强。遗传转化结果证明BnaA03.MKK4-BnaA06.MAPK3/Bna C03.MAPK3介导的MAPK级联反应增强了甘蓝型油菜菌核病抗性,是植物体防御核盘菌感染的一条重要的应答路径。4.BnaA09.VQ12是BnaA03.WRKY28的辅助因子。VQ蛋白通常会与WRKY转录因子形成复合体,油菜受到核盘菌感染后BnaA09.VQ12与BnaA03.WRKY28具有相似的诱导表达趋势;通过Y2H、Bi FC、pull-down、Co-IP等试验证实了BnaA09.VQ12和BnaA03.WRKY28之间相互作用。在细胞核中,BnaA09.VQ12是通过结合到BnaA03.WRKY28的DNA结构域而与BnaA03.WRKY28形成蛋白复合体。此外,超表达BnaA09.VQ12减弱甘蓝型油菜菌核病抗性,而敲除BnaA09.VQ12增强抗病性。在甘蓝型油菜响应核盘菌感染的过程中,BnaA09.VQ12与BnaA03.WRKY28呈现出相似的生物学功能。5.BnWRKY33和BnaA03.WRKY28在菌核病抗性中的关系。BnWRKY33在核盘菌感染的早期高表达,而BnaA03.WRKY28在核盘菌感染的后期高表达,并且BnWRKY33在防御反应后期的表达显著低于早期。超表达BnaA03.WRKY28和BnaA09.VQ12抑制了植物体在防御反应早期BnWRKY33的表达;而BnaA03.WRKY28基因编辑株系和BnaA09.VQ12基因编辑株系中,BnWRKY33的表达持续维持在较高的水平。体外EMSA试验表明,BnaA09.VQ12通过结合BnaA03.WRKY28的DNA结构域增强BnaA03.WRKY28对BnWRKY33启动子的结合能力。体内双萤光素酶报告分析进一步表明,通过与BnaA09.VQ12形成复合体,BnaA03.WRKY28相比于BnWRKY33对BnWRKY33启动子的亲和力更强。6.BnaA03.WRKY28促进甘蓝型油菜侧枝形成。田间表型考察发现BnaA03.WRKY28超表达株系产生更多的分枝,特别是在一个叶腋处产生两个或两个以上的分枝,并且产生更多的高阶分枝。GUS染色分析表明BnaA03.WRKY28在生长点、叶腋处表达。q PCR分析发现,接种核盘菌48 h后,BnaA03.WRKY28超表达株系中与分枝形成密切相关的BnBRC1和BnBRC2,以及生长素介导的分枝形成相关基因BnAXR1表达下调,而编码生长素运输蛋白的基因BnPIN1表达上调。此外,EMSA试验显示BnaA03.WRKY28与Bna C03.BRC1启动子直接结合。因此推测BnaA03.WRKY28可能通过直接调控Bna C03.BRC1的表达,以及通过影响生长素介导的分枝形成的信号通路参与甘蓝型油菜分枝形成。综上所述,在甘蓝型油菜遭受核盘菌危害时,植物体先天免疫系统被激活,MAPK级联通过磷酸化将胁迫信号级联放大,并直接作用于转录因子BnWRKY33。被磷酸化激活的BnWRKY33的转录活性显著增强,并通过结合自身启动子大量诱导BnWRKY33的表达,抗病反应增强。随着病原菌的持续感染,BnaA03.WRKY28和BnaA09.VQ12被诱导表达,BnaA09.VQ12与BnaA03.WRKY28发生蛋白相互作用后,BnaA03.WRKY28对BnWRKY33启动子的结合能力增强,从而优先于BnWRKY33与BnWRKY33启动子结合,使抗病反应强度减弱。同时,在防御反应后期,在叶腋处表达的BnaA03.WRKY28通过调控Bna C03.BRC1、BnPIN1等与分枝相关基因的表达促进油菜侧枝形成,以实现油菜菌核病响应过程中生长与防御之间的权衡。