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牡丹（PaeoniasuffruticosaAndr.）是原产自我国的特有名贵花卉，被世人传为百花之灵。牡丹具有深休眠特性，适量的低温是打破牡丹花芽休眠的有效途径。黄鑫等以牡丹品种‘鲁荷红’为试材，利用抑制性差减杂交(SSH)技术，构建与花芽休眠解除相关的cDNA文库，其中赤霉素合成酶基因PsGA20是筛选到的差异基因之一。GA20氧化酶基因是多基因编码的赤霉素合成关键限速酶，在转录表达过程中受活性赤霉素的反馈调节作用。研究赤霉素合成酶基因Psi20与牡丹花芽内GA之间的关系对牡丹休眠解除的研究具有重要意义。本文以已经筛选的PsGA20氧化酶基因的部分cDNA序列为出发点，克隆其全长基因组序列，利用克隆测序的方法确定牡丹休眠解除过程中的PsGA20氧化酶基因家族成员，结合‘鲁荷红’休眠解除过程中花芽内源GA含量变化，从分子水平研究PsGA20氧化酶基因参与牡丹休眠解除的机理，以期为牡丹反季节催花和新品种的选育提供候选基因。
本实验选用山东菏泽牡丹基地4年生牡丹品种‘鲁荷红’（PaeoniasuffruticosaAndr.LuHeHong’）的健壮植株，采取不同低温处理，以植株顶芽为实验材料，采取CTAB法提取其基因组RNA、DNA，PCR扩增获得赤霉素合成酶基因PsGA20DNA全长;根据已知赤霉素合成酶基因PsGA20的cDNA，设计兼并引物确定与牡丹品种‘鲁荷红休眠解除相关的PsGA20氧化酶基因的家族成员;结合酶联免疫法测定GA含量;半定量RT-PCR分析赤霉素合成酶基因PsGA20在牡丹休眠解除不同时期的表达变化。本实验结果以期为完善牡丹的反季节催花技术的理论体系及构建转基因牡丹植株提供理论依据。
主要试验结果如下:
1、对牡丹‘鲁荷红’花芽采取低温感受0d、5d、10d、15d、23d处理后观察得出:牡丹‘鲁荷红’单独采用4℃冷库处理0d、5d时花芽没有萌动，在低温处理10d时牡丹花芽萌动，但不能正常开花展叶，直至23d左右可以彻底解除休眠，‘鲁荷红’正常开花展叶;
2、PsGA20基因组全长为1606bp，含有一个内含子，两个外显子。PsGA20氧化酶基因与毛果杨（PopulustrichocarpaXP_002306662.1）同源性最近，位于进化树的同一分支，相似度为69.5％。与欧白英（SolanumdulcamaraCAB82616.1）同源性最远，相似度为51.5％。
3、根据同源序列设计兼并引物进行PCR扩增，BLAST分析结果显示，赤霉素合成酶基因PsGA20家族成员在牡丹‘鲁荷红’休眠解除过程中，PsGA20家族成员可能只有一个。
4、在已知的鲁荷红PsGA20基因cDNA中设计长度为415bp的引物进行半定量RT-PCR，实验证明在牡丹休眠解除过程中，随低温处理时间的延长，赤霉素合成酶基因PsGA20表达量在牡丹花芽休眠解除前期（低温处理0d-10d）呈现上升趋势，在低温处理10d时达到最高值，而在休眠解除的后期（低温处理15-23d）呈现下降的趋势。
5、酶联免疫吸附检测法(ELISA)测牡丹花芽内GA含量显示，GA在牡丹休眠解除过程中呈现先上升后下降的趋势，变化趋势与赤霉素合成酶基因PsGA20的表达基本符合，推测在GA对牡丹‘鲁荷红’休眠解除过程进行调控作用时，PsGA20基因起到促进作用，研究该基因对从分子水平上研究牡丹休眠解除的调控机制具有重要作用。