论文部分内容阅读
研究背景1989年Krajden等学者首次于口腔菌斑生物膜和唾液中发现了幽门螺杆菌菌株[1],随后1991年Desai等学者也分别从牙菌斑中检测出幽门螺杆菌[2],证实这种病原体可存在于口腔中,并拉开了研究口腔内幽门螺杆菌的序幕。随后学者通过不同的检测方法发现幽门螺杆菌在口内可定植在口腔环境中的龈上菌斑、龈下菌斑、唾液、黏膜等部位,并且龈下菌斑中的检出率较高。幽门螺杆菌具有鞭毛、黏附素、毒力蛋白、LPS等毒力因子,可对宿主造成免疫及炎症损伤。现多项研究表明,口腔是幽门螺杆菌定植的胃外最大贮存点。在相关的临床研究及系统分析结果中发现[9,10,12],牙周炎位点的幽门螺杆菌检出率更高,幽门螺杆菌感染与牙周炎有一定的相关关系,口腔中幽门螺杆菌的存在是慢性牙周炎的危险因素之一。而在牙周炎症发生时,牙周袋上皮是细菌生物膜和结缔组织的唯一屏障。袋内上皮通常有表面侵蚀或溃疡,可暴露下面的炎性结缔组织。牙周炎为慢性疾病,胶原纤维的修复在疾病过程中具有重要的作用,牙周结缔组织中的牙周膜成纤维细胞容易受到牙周病原微生物的损伤,导致其增殖能力受抑制或形态的特性改变。故本实验拟探究幽门螺杆菌感染人牙周膜成纤维细胞后对细胞的侵袭作用和增殖的影响,探讨其在牙周组织的病理损伤机制的可能性。材料与方法1.幽门螺杆菌SS1及人牙周膜成纤维细胞的培养及鉴定幽门螺杆菌标准株SS1来源于广州市南方医院消化科孙勇教授,本课题实验组负责复苏保存。配制含6%新鲜羊血的哥伦比亚琼脂血平板,将冻存的幽门螺杆菌标准株SS1接种到哥伦比亚琼脂血平板中,平板置于厌氧罐中,调节罐内气体环境为微需氧环境,湿度>90%,恒温37℃培养2d后进行革兰染色及菌种测序。从南方医院口腔科收集14-25岁健康无龋的前磨牙,刮取牙周膜进行牙周膜成纤维细胞的原代培养,细胞培养至80%时传代,取第3-6代细胞通过CCK8法测定体外生长情况及免疫荧光染色鉴定来源。2.幽门螺杆菌侵袭模型的建立及其电镜观察通过庆大霉素保护实验建立幽门螺杆菌侵袭人牙周膜成纤维细胞模型。按感染复数MOI=100:1加入相应的菌液量至细胞培养基中,分别共培养2、4、6、8、10 h后用含庆大霉素(100 μg/mL)培养基孵育2h杀死细胞外的幽门螺杆菌,洗涤并消化收集细胞,将细胞裂解液梯度稀释涂板,微需氧培养6 d后菌落计数。通过计算侵袭效能确立本实验侵袭模型,通过电镜观察侵袭情况和细胞形态变化。3.幽门螺杆菌感染对人牙周膜成纤维细胞增殖能力的影响建立高浓度及低浓度的侵袭模型,并用含庆大霉素(100 μg/mL)培养基孵育2 h杀死细胞外的幽门螺杆菌。细胞用4%福尔马林20 min固定,0.2%Triton X-100渗透、血清阻断、Ki-67、DAPI抗体逐步孵育检测核增殖抗原Ki-67的表达情况,并用CCK8法检测细胞连续7 d的增殖情况。4.幽门螺杆菌感染对人牙周膜成纤维细胞细胞周期的影响及其机制建立高浓度及低浓度的侵袭模型,并用含庆大霉素(100 μg/mL)培养基孵育2 h杀死细胞外的幽门螺杆菌。体外侵袭模型建立后添加70%冷乙醇固定细胞,在-4℃冰箱中存放过夜,次日染色之前,用无菌PBS洗一次,离心弃上层清液,添加酶染色工作液。流式细胞仪上机检测。用总RNA提取试剂盒分离三组样本的总RNA,逆转录成cDNA。使用SYBRPremix Ex Taq检测Cdc25C、CDK1、cyclinB 1的转录情况。提取蛋白后主要抗体探测:Cdc25C、Cdc25C-S216、CDK1、CDK1-Y15、cyclinB1。最后,采用化学发光检测系统。结果1.幽门螺杆菌标准株SS1可侵入至人牙周膜成纤维细胞中,对细胞形态有影响本实验成功对正常人牙周膜成纤维细胞进行原代培养及分离,并构建了幽门螺杆菌标准株SS1侵袭细胞的体外模型。在6 h的侵入模型中,幽门螺杆菌标准株SS1的侵袭效率佳,通过倒置显微镜中观察到幽门螺杆菌感染后部分人牙周膜成纤维细胞形态变圆,幽门螺杆菌黏附于细胞膜表面。透射电子显微镜可见幽门螺杆菌可侵入细胞,并被液泡包裹着定位于细胞质中,细胞内液泡增多,液泡内的幽门螺杆菌呈现杆菌样和球菌样。2.幽门螺杆菌标准株SS1侵袭细胞后可通过Cdc25C/CDK1/cyclinB1级联反应导致G2期阻滞及抑制细胞增殖通过CCK8法和Ki-67蛋白免疫荧光染色的结果中可见,幽门螺杆菌标准株SS1侵袭细胞后可导致细胞的增殖受到抑制,并且幽门螺杆菌标准株SS1感染的浓度越高,抑制细胞增殖的情况越明显。通过流式细胞术检测可见,G2期DNA含量随感染浓度增加而升高,细胞G2期发生阻滞。幽门螺杆菌标准株SS1感染后可导致人牙周膜成纤维细胞的G2期的相关调节蛋白cyclinB1、CDK1、Cdc25C的转录和表达失常,并且CDK1-Y15和Cdc25C-S216磷酸化蛋白增加,导致G2期阻滞。结论1.本实验所构建幽门螺杆菌标准株SS1侵袭人牙周膜成纤维细胞的体外模型,具有较好的侵袭率,能体外模拟不同浓度幽门螺杆菌标准株SS1对细胞的作用。2.通过透射电子显微镜及倒置显微镜结果,可见幽门螺杆菌标准株SS1可黏附及侵袭人牙周膜成纤维细胞,侵入细胞后幽门螺杆菌定位于细胞质中,并被液泡包裹,细胞形态由扁长变圆。细胞内液泡增多,液泡内的幽门螺杆菌呈现杆菌样和球菌样。3.幽门螺杆菌标准株SS1感染后可导致正常牙周膜成纤维细胞的增殖受到抑制。感染浓度越高,抑制细胞生长的能力越明显,说明幽门螺杆菌标准株SS1对正常牙周膜成纤维细胞有损伤作用。4.通过检测G2期的细胞周期相关调节蛋白的转录水平和蛋白水平可发现,幽门螺杆菌标准株SS1通过影响Cdc25C/CDK1/cyclinB1通路的调节导致G2期阻滞,有丝分裂受阻,抑制细胞增殖。