研究背景：目前临床应用的抗心律失常药物主要是阻断心肌Na+、K+、Ca2+离子通道，但其致心律失常副作用也引起了普遍担忧，寻找抗心律失常的新靶点和新机制一直是一个研究热点。 Zacopride属苯甲酰胺衍生物，兼有5-HT3受体抑制剂和5-HT4受体激动剂的性质，作用于胃肠5-HT4受体促进乙酰胆碱释放，对实验动物胃肠道具有促动力作用。在一项比较50HT4受体激动剂西沙比利(cisapride)、RS67506和zacopride致心律失常副作用的研究中发现，与西沙比利显著的促心律失常副作用不同，zacopride对心律和心功能均无明显影响。探究其作用的离子机制发现，西沙比利和RS67506可抑制对大鼠心室肌IK1，而Zacopride对大鼠心室肌IK1表现出显著的激动作用，对内向电流和外向电流部分均有明显增强效应；同时表现出明确的通道选择性，对ICa—L，INa，Ito，Isus，INa/Ca，Ipump等其他影响动作电位的主要离子流均无显著作用。这提示我们Zacopride很可能是IK1选择性激动剂和潜在的抗心律失常药物。 目的： 1．确证zacopride为大鼠心肌细胞内向整流钾通道(IK1)特异性激动剂； 2．探讨zacopride增强IK1可能的受体和信号转导机制； 3．建立大鼠心脏乳头肌延迟后除极(DADs)和触发活动(TA)模型，检验zacopride对DADs和TA的影响； 4．建立大鼠离体和在体心律失常模型，检验zacopride对多种原因所致室性心律失常的影响； 5．应用低浓度Ba2+(IK1相对特异性阻断剂)对IK1的抑制作用，证实特异性增强IK1与抗心律失常效应之间的关系。 方法： 1．采用胶原酶法急性分离大鼠(或豚鼠)左心室肌细胞。选用健康成年雄性SD大鼠(体重220～250g)或豚鼠(体重280～350g)，于术前15分钟腹腔静脉注射肝素(1000U/kg)，戊巴比妥钠(65mg/kg，ip)麻醉后颈动脉放血，迅速开胸取出心脏，置于4℃用100％氧气饱和的无钙台氏液中修剪，然后将心脏悬挂在Langendorff灌流装置上经主动脉逆行灌流。先用无钙台氏液灌流8～10分钟，再用胶原酶液循环灌流15～20分钟。灌流过程中保持37℃恒温，灌流压80cmH2O，并持续通以100％氧气。待心室肌组织变大、变软后将左心室剪下，置于KB液中剪碎，轻轻吹打得到分散的左心室肌细胞，经150μm孔径的滤网过滤后保存于KB液中，室温放置5～6小时后进行实验。实验前先将存放于高钾KB液中的细胞逐步复钙，然后取几滴细胞悬液加入细胞池(约1ml)，平放在连有微操纵仪的倒置显微镜上静置10min，待细胞充分贴壁后，用台氏液灌流，流速为2ml/min。玻璃电极内充灌电极内液，电阻约2～5MΩ。选取杆状、横纹清晰、无自主收缩的的心肌细胞进行实验。形成高阻抗(＞1GΩ)封接后，用负压破膜，进行全细胞记录。离子电流信号经Axopatch200B膜片钳放大器、Digidate1322A模数转换器及Pclamp8.0采集、贮存及分析，并保存在电脑硬盘中备用。 应用全细胞膜片钳技术，在电流钳模式下记录静息膜电位(RMP)和动作电位(AP)，在电压钳模式下记录心肌细胞膜L—型钙电流(ICa—L)、电压门控钠电流(INa)、内向整流钾电流(IK1)、瞬时外向钾电流(Ito)、持续外向延迟整流钾电流(Isus)、延迟整流钾电流(IK，豚鼠)、钠钙交换电流(INa/Ca)、钠钾泵电流(Ipump)和ATP敏感钾电流(KATP)。应用电流密度(即单位膜电容的膜电流)表示膜电流的大小。观察①Zacopride对各离子通道的电流一电压关系曲线(I-V曲线)的效应；②Zacopride对IK1作用的最大增幅、最大效应浓度以及能抵消zacopride对IK1最大增强效应的BaCl2浓度(用于第4部分离体心脏灌流模型的研究)；③Zacopride对静息膜电位、动作电位幅度和时程的影响。④Zacopride对静息膜电位和IK1作用的时间过程。 2．应用膜片钳技术，分别观察10μmol/L5-HT4受体阻断剂RS23597-190，10μmol/L5-HT3受体激动剂m—chlorophenylbiguanide，5μmol/LPKA抑制剂KT5720，5μmol/LPKC抑制剂GF109203x和5μmol/LPKG抑制剂KT5823对zacopride增强IK1作用的影响。 3．在大鼠乳头肌建立DADs和TA的模型。取健康雄性SD大鼠14只，体重220～250克，戊巴比妥钠按65mg/kg腹腔麻醉后迅速开胸取出心脏，浸入100％O2饱和的冰台氏液中洗净残血，沿前室间沟左缘剪开左室，小心切取5～6mm长，2～3mm宽的左室乳头肌，置于组织灌流槽中，用不锈钢针固定于槽底的硅胶板上。标本以95％O2-5％CO2混合气体平衡的台氏液循环灌流。以多导电子刺激器产生的串刺激作为诱发DADs和TA的条件刺激，每个串刺激为6个连续脉冲，脉冲周期长度(BCL)为200ms，脉宽2ms，强度为2倍阈值。玻璃电极内充以3mmoo/LKCl，电阻10～20MΩ。稳定1小时后，使用三维液压式微操纵器将微电极插入单个心肌细胞内，引出正常动作电位。之后于灌流液中加入异丙肾上腺素(终浓度1μmol/L)，采用上述条件刺激诱发DADs和TA。Zacopride预处理组则预先用zacopride(基于膜片钳结果，浓度为激活IK1最大效应浓度)灌流组织，10分钟后再给予异丙肾上腺素，用药前后采用相同的条件刺激诱发DADs和TA，观察zacopride对异丙肾上腺素诱发DADs和TA的影响，比较两组DADs和TA的发生率。 4．Zacopride对多种心律失常模型的效应。 (1)大鼠离体心脏心律失常模型: 1)离体心脏缺血性或再灌注性心律失常模型。 实验分组：①单纯缺血组(对照组)或单纯缺血再灌注组(对照组)；②缺血(或再灌注)+Zacopride不同浓度组；③缺血+Zacopride+BaCl2组。 2)离体心脏乌头碱心律失常模型。 造模方法：大鼠，麻醉，开胸，取出心脏行Langendorff主动脉逆行灌流，记录心电图。 实验分组：①给药组(n=8)；②对照组(n=8)。 观测指标：比较乌头碱中毒对照组与zacopride处理组室性心律失常(包括室早、室速、室颤)的持续时间。 (2)大鼠在体心律失常模型： 1)在体缺血性或再灌注性心律失常。 造模方法：SD大鼠，麻醉，开胸，记录心电图，结扎冠脉左前降支，局部缺血15分钟，松扎后再灌注15分钟。不同剂量的Zacopride或Lidocaine7.5mg/kg于缺血前或再灌注前3分钟由股静脉注射，观测量效关系。 观测指标：分别累计缺血后15分钟和再灌注后15分钟内心律失常潜伏期，期前收缩次数，室速持续时间和发生率，室颤持续时间和发生率。 2)在体乌头碱心律失常模型。 造模方法：SD大鼠，麻醉，记录心电图，在3秒内由舌下静脉一次性注射乌头碱30μg/kg，诱导出稳定的心律失常。Zacopride处理组在注射乌头碱后立即由股静脉注射zacopride。 观测指标：比较乌头碱中毒组与zacopride给药组室性心律失常(包括室早、室速、室颤)的持续时间。 结论： 1．zacopride为大鼠心室肌IK1特异性激动剂，在0.1～10μmol/L范围内，可显著增强IK1；相同浓度范围的zacopride对大鼠ICa—L、INa、Ito、Isus、INa/Ca、Ipump、KATP和豚鼠IK均无显著影响。 2．在0.1～10μmol/L范围内，Zacopride可显著增大(超极化)静息电位，增加动作电位幅度，缩短动作电位时程。 3．Zacopride对IK1的激动作用经由PKA介导的信号转导通路，其效应不依赖于5-HT3和5-HT4受体。 4．zacopride可有效抑制异丙肾上腺素诱发的延迟后除极和触发活动。 5．zacopride对大鼠心脏缺血性、再灌注性及乌头碱中毒所致的心律失常均有明显抑制作用，其抗心律失常效应主要由药物增强心室肌细胞IK1所介导；zacopride对缺血性和再灌注性心律失常的效应与经典药物利多卡因(lidocaine)相似，最大效应浓度为1μmol/L，远低于zacopride促胃肠动力效应和中枢效应的有效浓度。 6．Zacopride作为心室肌IK1特异性激动剂，不仅是一个潜在的抗心律失常药物，也是研究IK1通道功能的极有价值的工具药。