【摘 要】
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新型冠状病毒病（corona virus disease 2019,COVID-19）的病原是严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）,病毒通过S蛋白上的受体结合域RBD与细胞受体ACE2结合进入细胞,感染人体后能够引起包括呼吸道疾病在内的全身损伤。纳米抗体（nanobody,Nb）作为
【基金项目】
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宁夏回族自治区重点研发计划（2020BFG02017）; 国家自然科学基金项目（32002236,32072796）
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新型冠状病毒病（corona virus disease 2019,COVID-19）的病原是严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）,病毒通过S蛋白上的受体结合域RBD与细胞受体ACE2结合进入细胞,感染人体后能够引起包括呼吸道疾病在内的全身损伤。纳米抗体（nanobody,Nb）作为小分子抗体的成员之一,与传统的抗体相比免疫原性更弱、穿透性更强、稳定性更好且对抗原的亲和力更高,针对S蛋白的纳米抗体可以特异性靶向新冠病毒S蛋白的受体结合域RBD,阻止其与细胞膜受体ACE2结合。铁蛋白（Ferritin）能够自组装形成天然的蛋白纳米笼,在蛋白展示、抗原呈递、药物靶向输送等方面具有良好的应用前景,将纳米抗体与铁蛋白相融合,利用其自组装的特性,使纳米抗体以24聚体的形式展示在铁蛋白表面,可以提高纳米抗体对S蛋白的靶向亲和力从而提高其中和活性。本研究选取SARS-CoV-2的中和性纳米抗体H11-D4,通过Linker与人的铁蛋白重链C端连接,分别利用大肠杆菌和家蚕杆状病毒表达系统表达重组蛋白H11-D4、Fe-H11-D4,并通过假病毒中和试验检测目的蛋白的中和活性,具体研究内容如下:将SARS-CoV-2中和性纳米抗体H11-D4基因与人铁蛋白重链基因优化合成后克隆至原核表达载体p ET28a上,转化至Rosetta（DE3）菌株中表达,获得目的蛋白H11-D4、Fe-H11-D4。纯化后获得的H11-D4、Fe-H11-D4产量分别为25.16mg/L、8.70mg/L。透析复性后透射电镜观察到铁蛋白融合H11-D4能自组装为20nm左右的球状结构,H11-D4展示在铁蛋白的表面。将复性后的目的蛋白进行假病毒中和试验,结果表明H11-D4与Fe-H11-D4可以阻止假病毒进入细胞,具有中和假病毒的能力,IC50分别为171.10nmol/L和20.87nmol/L,与铁蛋白融合表达的纳米抗体中和活性明显高于单独表达的纳米抗体,证明铁蛋白表面多聚纳米抗体提高了对S蛋白的靶向亲和力。将H11-D4和Fe-H11-D4基因克隆到杆状病毒转移载体p BR上,与失活拯救型杆状病毒DNA共转染家蚕Bm-N细胞,获得重组杆状病毒re Bam Bac-H11-D4、re Bam Bac-Fe-H11-D4,将其感染家蚕后收集蚕血淋巴,用ELISA检测到Fe-H11-D4的表达量为101.23μg/m L。将Fe-H11-D4进行超离纯化后电镜观察,可以观察到铁蛋白-纳米抗体融合蛋白Fe-H11-D4在家蚕中自组装成20nm左右的天然球型结构,H11-D4展示在铁蛋白的表面。通过假病毒中和试验测得蚕血淋巴中H11-D4、Fe-H11-D4的中和滴度分别为1:1226、1:2080。根据蚕血淋巴中Fe-H11-D4蛋白的浓度计算出Fe-H11-D4的IC50=1.46nmol/L,IC50显著高于原核表达的Fe-H11-D4,证明蚕血淋巴表达的融合蛋白中和活性高于原核纯化复性后的铁蛋白融合蛋白的中和活性,体现了家蚕杆状病毒对外源蛋白翻译后加工修饰的优势。本研究将纳米抗体与铁蛋白融合表达,基于铁蛋白自组装的特性,利用大肠杆菌和杆状病毒表达系统将纳米抗体以24聚体的形式展示在铁蛋白表面,实验结果显示利用铁蛋白展示多聚的纳米抗体可以显著提高纳米抗体对S蛋白的靶向亲和力从而提高其中和活性。且杆状病毒表达系统具有翻译后加工修饰的功能,因此可以将铁蛋白纳米笼展示多聚蛋白的功能得以最大程度的利用,这为建立一种低成本、高中和活性的新冠病毒诊断和治疗药物奠定了一定的基础。
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