【摘 要】
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D-塔格糖是一种在自然界中存在但含量极少的天然己酮糖,具有抗龋齿、改善肠道菌群、降血糖等多种生理功能,在食品、医药及化妆品行业备受青睐,是最近几年研究的热点。实验室
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D-塔格糖是一种在自然界中存在但含量极少的天然己酮糖,具有抗龋齿、改善肠道菌群、降血糖等多种生理功能,在食品、医药及化妆品行业备受青睐,是最近几年研究的热点。实验室筛选得到一株能产L-阿拉伯糖异构酶的短乳杆菌Lactobacillus brevis sp.D-tag 1(L.brevis sp.D-tag 1),L.brevis sp.D-tag 1是一株食品级优良菌株,是生产D-塔格糖的理想菌株。本文利用L.brevis sp.D-tag 1为发酵菌株,探究了其培养和产酶条件,纯化了L-阿拉伯糖异构酶L-arabinose isomerase(L-AI),表征了L-阿拉伯糖异构酶的酶学性质,实现了D-半乳糖到D-塔格糖的高效转化。本文采取单因素实验对L.brevis sp.D-tag 1菌株的发酵培养条件进行优化,确定发酵优化培养基为(g/L):L-阿拉伯糖5、玉米浆20、磷酸三钾0.2、七水合硫酸镁0.05、乙酸钠10。发酵优化条件为:初始pH 6.0-6.2,培养温度37℃,培养时间24 h。经优化后酶活提高了3倍左右。L-阿拉伯糖异构酶是一种胞内酶,对L.brevis sp.D-tag 1来源的L-AI进行提取及分离纯化。首先采用细胞破碎法获得破碎上清,即为粗酶液。然后采用硫酸铵分级沉淀(饱和度区间为(60%-80%)、透析脱盐、过DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析柱、Native-PAGE凝胶回收的方法得到纯的L-AI。采用SDS-PAGE检测L-AI纯度和分子大小,Native-PAGE检测L-AI单聚体情况。对纯化后的L-AI进行酶学性质分析,L-AI的最适反应温度为65℃,最适pH 7.0。在低于75℃,pH 6.0-9.0之间酶活力稳定。Mg2+,Co2+,Mn2+对酶反应有促进作用,其中Co2+,Mn2+促进作用较为突出,Cu2+,Ca2+对酶反应有抑制作用。L-AI的相对分子质量为60.1 kDa,以单体形式存在。酶反应动力学方程为:V=0.045[s]/(129+[s]),Km=129 mM,Vmax=0.045±0.0012 mM min-1。对细胞转化法生产D-塔格糖的工艺条件进行优化,并分别利用细胞和L-AI作为催化剂以D-半乳糖为底物生产D-塔格糖。反应完成后转化率可达到45.1%,转化率较高,细胞催化反应所需时间为48 h,细胞可重复使用3次。L-AI催化反应需要23 h,但L-AI仅可反复使用2次。
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