论文部分内容阅读
总所周知，纤维素是最廉价的可再生资源，它在全球上分布范围广、蕴藏量极其丰富，然而这种资源有很多不能被直接利用，从而成为了纤维素废物。在我国几乎所有的纤维素废物（作物秸秆、废纸、废木料）不是白白烧掉就是直接丢弃。这种不科学的处理不但造成了数十亿的直接经济损失，并且焚烧过程中产生的大量有害气体等废弃物对我们生存环境和生态造成了严重影响。由于纤维素的难降解的分子结构，这些纤维素废物不能得到很好地再利用。纤维素酶虽然已经应用在工业上，但是纤维素酶的酶活力、最适温度、最适PH值、pH的稳定性能和热稳定性能等生物酶学指标仍然需要继续提高才能够满足工业生产需要。热稳定纤维素酶的主要来源为嗜热微生物，一般来说产生于嗜热真菌的纤维素酶能够在高温下具较强稳定性和较高活力，并且同中温真菌产生的纤维素酶一样一般含有多种组分。 本研究中从嗜热子囊菌光孢变种（Thermoascusaurantiacusvar.levisporus）中克隆出eg(1)基因(GenBank登录号为AY847014)和61f基因(GenBank登录号为KF170230)，然后通过融合PCR的方法，构建融合蛋白表达载体，与真核表达载体pPIC9k相连后，转化毕赤酵母GS1l5，筛选阳性克隆，甲醇诱导表达，优化产酶条件，纯化表达产物，测定纤维素酶活性及特性，与原始酶单独作用的酶活性做比较，筛选到纤维素酶活性最高的融合蛋白酵母工程菌株，命名为61F-EG1，该菌株所表达的酶具有很好的热稳定性。61F-EG1产生的酶蛋白分子量为58.8kDa，最适温度为60℃，在80℃下保温60min后仍然剩下75.65％的酶活力，90℃的半衰期为50min，酶活性仍在51％，最适pH值为5.0，在pH4.0-6.0的条件下酶活力能够保持稳定。经纯化后测得蛋白含量1.31mg/ml，酶活为10.89U/ml。通过与原始酶61F和EG1（61F活性很微弱，EG1表现为内切酶活性）进行活性比较发现，融合体的酶活约为EG1酶活的2.7倍。