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红景天为传统的藏药,具有抵抗高原反应、抗缺氧、抗疲劳和抗氧化的功效,但是由于生长环境特殊,人工采挖严重,造成红景天资源日益减少；红景天种子自然萌发率极低,采用根茎进行营养繁殖时,腐烂现象十分严重,至今没有大面积人工栽培成功的报道。本文以解决大花红景天(Rhodiola crenulata)资源短缺为目的,建立红景天的指纹图谱,对大花红景天进行组培快繁、种质资源冷冻保存及生物反应器大规模培养的研究,获得结果如下：
⑴建立了大花红景天指纹图谱的高效液相色谱方法,并用此方法分析了其它种的红景天(云南红景天、玫瑰红景天、高山红景天和圣地红景天)的指纹图谱。以相对峰面积和相对保留时间分析了不同种的红景天色谱图,结果表明,各种红景天共有峰的相对保留时间差异不大,但共有峰的相对峰面积差别较大,说明共有峰可以作为该属植物的特征成分,相对峰面积的差别则反映了不同种的红景天的有效成分之间相对含量的差异。应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A版)生成了不同种的红景天的标准指纹图谱,大花红景天与其他四个种的相似度均低于0.630,不同种的红景天之间的相似度差异较大,表明建立的色谱指纹图谱方法可以很好的区分不同种的红景天。作为药典指定的红景天属的唯一种大花红景天,其红景天苷及酪醇含量均高于其他种,因此选择大花红景天作为研究的对象。
⑵以野生大花红景天的叶片为外植体进行芽再生,最佳的激素组合为MS培养基中添加15 pM6-苄氨基嘌呤(6-benzylaminopurine,6-BA)和2.5μM赤霉素(Gibberellin,GA3)。芽生根成苗的最佳培养基为添加5μM的3-吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid,IAA)的MS培养基。将叶片外植体在黑暗处理5 d后可显著提高不定芽的出芽数,暗处理5 d的植物材料的内源玉米素(Zeatin,ZT)和赤霉素的含量及ZT与IAA的比值显著提高,同时黑暗预处理5 d还降低了内源的多酚氧化酶的活力,从而抑制了褐化现象。
⑶建立了大花红景天玻璃化法超低温冷冻保存的工艺,将大花红景天愈伤组织在添加5％二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide,DMSO)和5％蔗糖的固体MS培养基上预培养7 d,然后在添加60％冷冻保护液PVS2中25℃装载60 min,再转入100％PVS2保护液中0℃下脱水60 min后保存到液氮中,可获得46.6％的成活率和30.5％的再生率。在超低温保存前将大花红景天愈伤组织置于含褪黑素的培养基上预处理,浓度为0.1μM的褪黑素预处理5 d,大花红景天愈伤组织的超低温保存成活率由46.6％提高到72.2％,再生率由30.5％提高到53.0％。经过褪黑素预处理的大花红景天愈伤组织的过氧化物酶(Peroxidase,POD)和过氧化氢酶(Catalase,CAT)的活力比未经处理的愈伤组织的酶活高,褪黑素预处理后的红景天愈伤组织的丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量比对照减少。
⑷采用自制的间歇浸没式生物反应器对大花红景天丛生芽进行增殖培养,间隔300min浸没3 min为最佳间歇浸没周期,丛生芽的增殖率达到最大为46.8,玻璃化率为35.4％；在间歇浸没式生物反应器内增加强制通风,在间歇浸没周期为3 min/180 min的周期下,强制通风速率为40 L/h时,丛生芽的增殖率最大达到了55.7,玻璃化率降低至26.1％。