油松(Pinus tabulaeformis Carr.)是我国特有的造林与绿化树种,其胚珠发育过程较为缓慢,不同阶段性状变化明显,是研究裸子植物胚珠发育的良好材料。雌配子体游离核细胞化时期是油松胚珠发育的一个关键时期,该时期内雌配子体游离核细胞壁逐渐形成,贮存物质开始积累。细胞化过程中多种基因的表达调控将直接影响油松种子的大小及质量。蛋白质是功能基因的表达产物,是生物功能的直接体现者。因此,研究该过程中差异表达蛋白质组,对探究油松胚珠发育的分子调控机制有着重要的意义。本论文采用荧光差异二维凝胶电泳(2D-DIGE)等蛋白质组学技术,辅以细胞学、植物生理学和分子生物学研究手段,对油松雌配子体游离核细胞化的差异表达蛋白质组进行了研究,主要成果及发现如下：1.对雌配子体游离核细胞化过程中显微、超微结构的变化进行了观察,结果表明,随着油松雌配子体细胞化过程的推进,雌配子体细胞壁逐渐形成并增厚,细胞质以及内质网、高尔基体等细胞器逐渐增多,整个细胞化过程中线粒体含量丰富；细胞化后期,雌配子体中有大量的脂滴累积,说明此阶段蛋白质、脂类的合成活动旺盛；细胞化过程中,雌配子体质外体途径中的过氧化氢在细胞壁上累积,推测过氧化氢可能影响着细胞壁的建成。2.建立了适用于油松胚珠蛋白质的2D-DIGE实验方案,即蛋白质提取时用冷丙酮漂洗5次蛋白质沉淀；染料标记时调节蛋白质溶液的浓度高于1.5 g·L-1；同时调整反应液pH值至8.5。以上条件的优化为油松雌配子体游离核细胞化的差异蛋白质组2D-DIGE研究奠定了实验基础,也为其他富含次生代谢产物的植物样本的2D-DIGE研究提供了一定参考。3.利用优化的2D-DIGE技术对油松雌配子体游离核细胞化前、中、后期的差异表达蛋白质组进行了分析,得到81个差异表达蛋白质点。在雌配子体游离核细胞化过程中,45个差异蛋白质表达上调,23个下调表达,13个蛋白质的表达量峰值出现在细胞化中期；经生物质谱分析,成功鉴定了47个蛋白质。蛋白质功能注释结果表明,其中7个蛋白质属于细胞骨架蛋白,5个参与抗氧化胁迫响应,11个与次生代谢产物和脂类合成相关,5个参与糖代谢,9个参与基因转录、翻译和蛋白质降解,2个与细胞信号转导相关。4.雌配子体细胞化过程中,mRNA预剪切因子CWC22、RNA解旋酶、26 S蛋白酶体和20S蛋白酶体表达上升,组蛋白H2A表达下降,说明细胞化过程中基因表达和蛋白质合成活动旺盛；丝氨酸羟甲基转移酶、谷氨酰胺合成酶、异黄酮还原酶、柠檬酸合酶、羟酰ACP脱水酶等次生代谢产物和脂类合成的关键酶在细胞化过程中表达量上升,烯醇化酶、果糖-二磷酸醛缩酶、磷酸丙糖异构酶等糖酵解途径的酶类表达量也有所提高,细胞化后期贮藏物质的合成活跃；α-微管蛋白、β-微管蛋白以及肌动蛋白等细胞骨架相关蛋白质上调表达,其功能可能是参与细胞壁物质的运输或定位；铁氧还蛋白-NADP还原酶、二氢硫辛酰胺脱氢酶和过氧化氢酶等具有过氧化氢清除活性的酶类在细胞化的过程中表达量提高,推测过氧化氢在油松雌配子体游离核细胞化过程中可能起到调控作用。5.通过抗氧化酶活性测定,验证了过氧化氢酶、超氧化物歧化酶的表达规律,同时发现,细胞化过程中雌配子体细胞膜脂的过氧化程度逐渐提高；确定了过氧化氢酶2对维持雌配子体细胞内活性氧含量稳定的重要作用；通过反转录荧光定量PCR技术,研究了超氧化物歧化酶、过氧化氢酶2、过氧化氢酶3、核酮糖1,5-二磷酸加氧/脱羧酶等基因在细胞化过程中的表达规律,验证了蛋白质组学的研究结果。