研究背景横纹肌溶解(rhabdomyolysis，RM)指任何原因引起的广泛的横纹肌细胞坏死,肌细胞内容物外漏至细胞外液及血液循环中，导致急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)、电解质紊乱等一系列并发症,重症患者预后极差。与肌红蛋白尿相关的AKI是创伤和非创伤性横纹肌溶解最严重的并发症，现有治疗无法根本改善其预后。如何提高RM后肾小管上皮细胞坏死的修复再生、降低AKI死亡率，一直是医学界研究的重大课题。近年来骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）在急慢性肾脏病中的应用日益受到关注，给AKI的治疗指明新的方向。多项研究均证实，MSCs治疗可明显改善肾小管损伤并有利于肾功能的恢复。巨噬细胞是天然免疫系统中重要的调节细胞,可分为经典活化的M1型巨噬细胞和替代性活化的M2型巨噬细胞两种极性状态。M2型巨噬细胞具有抑制炎症反应，促进组织重塑和再生修复的功能。体外研究中MSCs可与巨噬细胞相互作用，促进M2型巨噬细胞的产生。那么，诱导M2型巨噬细胞的生成是否是MSCs减轻AKI的机制？目前尚无相关报道。本研究旨在建立RM所致AKI的小鼠动物模型，探讨MSCs是否通过诱导M2型巨噬细胞的生成来减轻AKI，为阐明MSCs治疗减轻AKI的机制提供理论依据。方法第一部分C57BL/6小鼠经双下肢肌肉注射50%甘油8ml/kg建立RM所致AKI模型，观察第6h、12h、24h、48h、72h、96h、120h和168h时间点血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)和磷酸肌酸激酶(CK)的变化趋势，以及肾脏、肌肉和肺脏的病理改变。将C57BL/6小鼠随机分为Sham+生理盐水(NS)组、Sham+MSCs组、RM+NS组和RM+MSCs组。6小时后，MSCs组给予1×106个红色荧光蛋白（RFP）标记的C57BL/6小鼠骨髓来源的MSCs尾静脉注射, NS组给予等体积的生理盐水尾静脉注射；（1）生化检测血BUN、Cr和CK水平（n=10）；（2）酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清细胞因子IL-6、TNF-α和IL-10水平（n=5）；（3）光镜观察肌肉和肾脏病理损伤程度，计算肾小管坏死评分（n=4）；（4）PCNA免疫组化评价肾小管上皮细胞损伤后增殖情况（n=5）；（5）双光子显微镜检测RFP标记的MSCs在RM模型小鼠各器官的定植情况（n=3）。第二部分C57BL/6小鼠经50%甘油8ml/kg肌肉注射建立RM模型，随机分为RM+NS组和RM+MSCs组，n=5。取第24h、48h和72h的肾脏组织，免疫荧光技术检测巨噬细胞（F4/80）浸润数量的变化和M2型巨噬细胞（CD206）浸润数量的变化；Western Blot检测横纹肌溶解后不同时间点的肾脏组织M2型巨噬细胞标志物CD206的表达水平。第24小时，Western Blot检测sham+NS组、sham+MSCs组、RM+NS组和RM+MSCs组的M2型巨噬细胞标志物CD206表达情况。在损伤后第24小时，以MSCs治疗的横纹肌溶解AKI小鼠为研究对象，使用氯屈膦酸二钠脂质体清除其体内的巨噬细胞，空白脂质体作为对照，观察两组小鼠在第48h和72h血BUN、Cr和肾脏病理的改变。第三部分将小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞分为三组：常规培养的细胞为M0组，脂多糖（LPS）2.5ug/ml刺激2h的细胞为M1组，LPS刺激后并与MSCs共培养72小时的细胞为M2组。使用细胞免疫荧光检测三组细胞的巨噬细胞表面标志物F4/80和M2型巨噬细胞表面标志物CD206的表达，流式细胞技术检测各组的CD206和IL-10表达，ELISA检测不同时间点培养液上清IL-6、TNF-α和IL-10的水平（n=5）。使用氯膦酸二钠脂质体清除小鼠体内巨噬细胞，然后建立横纹肌溶解AKI模型，并随即尾静脉注射1×107个M0组、M1组和M2组的RAW264.7细胞（n=5）。在AKI的第72h检测血BUN、Cr和肾脏病理。结果本研究第一部分，成功建立了C57BL/6小鼠RM所致AKI模型，损伤后血BUN、Cr和CK进行性升高，并观察到CK于第24小时达峰值，BUN和Cr于第72小时达峰值的趋势。第6h经尾静脉注射1×106个MSCs或等体积的NS对照，发现MSCs治疗使RM小鼠血BUN、Cr和CK水平明显下降(P<0.01)，血促炎细胞因子IL-6和TNF-α的水平明显下降(P<0.01)，血抑炎细胞因子IL-10的水平明显升高(P<0.01)。肾组织PAS染色显示RM+MSCs组的肾小管损伤减轻，肾小管坏死评分下降。PCNA免疫组化见RM+MSCs组的肾小管上皮细胞明显增生。双光子显微镜活体检测MSCs主要定植在肺脏和肌肉，肾脏未发现RFP标记的MSCs，并用组织免疫荧光证实。本研究第二部分，组织免疫荧光发现RM发生后，肾脏的巨噬细胞浸润逐渐增加，RM+MSCs组肾组织CD206阳性的M2型巨噬细胞提前出现。WesternBlot证实RM+MSCs组肾脏M2型巨噬细胞标志物CD206的表达水平显著高于RM+NS组(P<0.01)，且表达在损伤后呈上升趋势。不同组肾脏CD206表达分析发现：损伤后第24小时，仅RM+MSCs组出现CD206的明显表达(P<0.01)。MSCs治疗AKI小鼠的巨噬细胞清除实验证实，在第24小时清除M2型巨噬细胞使第48h和72h小鼠的血BUN和Cr再次升高，伴肾脏损伤病理加重。本研究第三部分，细胞免疫荧光检测M0组、M1组及M2组的RAW264.7细胞均表达F4/80，仅M2组高表达CD206。流式细胞技术检测发现M2组的RAW264.7细胞高表达CD206和IL-10。ELISA测定RAW264.7培养液上清细胞因子浓度，LPS使IL-6和TNF-α的水平升高，MSCs使IL-6和TNF-α的水平降低、IL-10的水平升高(P<0.01)。氯屈膦酸二钠脂质体清除小鼠体内的巨噬细胞后建立横纹肌溶解AKI模型，空白脂质体作为对照组，给予不同组巨噬细胞过继转移，损伤后第72小时发现接受M2组RAW264.7细胞小鼠的血清BUN、Cr和病理损伤均较对照组、M0组和M1组明显减低(P<0.01)。结论（1）MSCs治疗可调节体内炎症反应，减轻RM所致AKI；（2）MSCs不通过直接定植于肾脏发挥保护作用；（3）MSCs治疗促进肾脏M2型巨噬细胞浸润的数量增加，清除巨噬细胞使已减轻的肾损伤再次加重（4）MSCs可在体外诱导巨噬细胞向M2型的转换。（5）过继转移M2型巨噬细胞可改善RM所致的AKI。