本课题的研究对象——乌菜产于我国长江流域一带,其主要是通过原十字花科芸薹在长期的自然选择中变异而来,同大多数植物一样,乌菜叶片也主要为绿色以及黄绿色,并结合不同的地理位置和气候条件呈现出不同的叶色。该植物为二年生草本植物【1】。因为乌菜营养丰富,味道鲜美,在全国各地均有引种栽培,并形成了许多地方品种。对植物所含营养指标进行评定时,花青素含量也是一个重要指标。花青素(Anthocyanidin)就是在各类植物中都广泛具有的一种类黄酮化合物有机物,具有较好的溶水性。其决定植物果实和花瓣颜色。花青素对于人体的健康会产生影响作用,在发挥作用时,主要是以一种抗氧化剂的形式参与到人体的新陈代谢中,从而提高肌肤活力,促进血液循环,从而来预防氧化和动脉硬化,另外该物质还能有效为人体提供低糖量的糖类物质,对于糖尿病患者而言,是能够帮助自身进行病情治疗的物质[6,7]。目前不管是医学方面还是生物方面,对于花青素的使用与研究处于比较深入的状态,很多专家学者从医学需要等方面出发,致力于通过生物技术进行人工花青素的合成。在合成的原料中,最为必要的是ANS反应酶,该酶可以促进花青素的有效合成,实现花色素有无颜色的顺利转变[8]。目前已经从拟南芥(Arabidopsisthaliana)、芥菜(Brassica juncea)、芥蓝B.alboglabra)、芜菁(B.campestris ssp.rapa)等十字花科植物中克隆到了ANS基因,但是对于乌菜ANS基因的实质性研究却还未开展【4-14】。因此笔者在结合前人的研究成功和经验的基础上,来对乌菜ANS克隆加以研究,同时对最终取得的成品进行基因的深入研讨,最后构建正义表达载体及遗传转化为乌菜分子育种奠定理论基础。主要研究成果如下:(1)通过Trisol法提取RNA,提取了红青菜和4种不同品种乌菜RNA,结合紫外分光光度计能够较为简单直接的测出成分的总体纯度,就本文得出的结果而言,最终可以看出乌菜RNA中的OD260为OD280的1.9倍左右,琼脂糖电泳检测也显示所提RNA较纯。将提取的5种不同试验材料RNA反转录成cDNA,通过实时荧光定量PCR试验选出4中不同品种乌菜花青素合成酶表达量最高的品种进行后续试验。(2)通过进行NCBI查找能够顺利找出十字花科植物的ANS序列,结合该序列以及其周围分布的其他序列号可以顺利找到氨基酸序列保守区。在找到相对应的序列保守区之后便能够根据显示的情况进行兼并引物的构建和设计。具体的设计流程如下:首先对需要加以克隆复制的基因进行分析,再将部分基因进行提取,采用RT-PCR实现基因的顺利克隆,在克隆结束之后,整个基因的长为1077bp,其含有的氨基酸为358。根据以上结果,对以往研究的植物基因加以比对后发现,乌菜的基因同荠菜,甘蓝存在很大的相似性,其同源性为96%以上。(3)37℃条件下将连接转化在PGM-T载体上的乌菜叶片ANS cDNA片段用SacⅠ和EcoRⅠ进行酶切,酶切所得产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后用回收试剂盒回收,其大小约为1077 bp的片段。载体PBI121也用SacⅠ和EcoRⅠ进行酶切,在16℃条件下用T4DNA连接酶将两个酶切产物连接,过夜。将上面得到的重组质粒中乌菜ANS片段正向插入35S启动子和TNOS终止子之间。成功构建ANS正义表达载体,为后续乌菜花青素应用研究奠定了基础。