第一部分妊娠期高血压疾病患者胎盘组织中内皮型一氧化氮合酶运输介导物表达的研究 目的:通过测定妊娠期高血压疾病孕妇胎盘组织中内皮型一氧化氮合酶运输介导物(NOSTRIN)及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达，探讨NOSTRIN在妊娠期高血压疾病发病中的作用机制。 方法:逆转录－聚合酶链反应(RT-PCR)检测23例妊娠期高血压疾病患者(病例组)和17例正常晚孕妇女(正常组)胎盘组织中NOSTRINmRNA的表达；Westernblot检测胎盘组织中NOSTRIN和eNOS蛋白质的表达；免疫组化染色法检测胎盘组织中NOSTRIN的表达，通过高清晰度彩色医学图文分析系统对其定量分析；HE染色观察胎盘绒毛血管病变；分光光度法测定胎盘组织中eNOS的活性；硝酸还原酶法测定胎盘组织中和外周血中的NO代谢产物亚硝酸基/亚硝基(NO2-/NO3-)。 结果:病例组胎盘组织中NOSTRINmRNA呈强表达，明显高于正常组(P＜0.01)；Westernblot显示两组胎盘组织中均有58kDa的NOSTRIN蛋白质表达，但病例组表达量明显增高(P＜0.01)，同时也均有145kDa的eNOS蛋白质表达，两组比较表达量无差异(P＞0.05)；免疫组化染色定量分析发现，NOSTRIN在病例组胎盘组织中的表达明显高于正常组(P＜0.01)；HE染色可见病例组胎盘细小血管壁增厚，管壁纤维素样坏死发生率显著高于正常组(P＜O.01)；病例组患者胎盘组织eNOS活性(13.727±3.58U/mg)与正常组(21.69±3.84U/mg)比较降低显著(P＜0.01)；病例组孕妇胎盘组织中的NO2-/NO3-(27.53±7.48μmol/mg)与正常组(54.27±9.53μmol/mg)比较显著降低(P＜0.01)；病例组孕妇外周血清NO2-/NO3-(38.56±8.49μmol/l)与正常组(65.37±9.61μmol/l)比较显著降低(P＜0.01)；病例组胎盘组织中NOSTRN表达水平与eNOS活性呈负相关(r=-0.57，P＜0.01)。 结论:妊娠期高血压疾病患者胎盘组织中NOSTRIN表达水平明显升高，eNOS活性降低，这可能在妊娠期高血压疾病的发病中起重要作用。 第二部分NOSTRIN基因克隆及其在HUVEC中的表达 目的:构建内皮型一氧化氮合酶运输介导物(endothelialnitricoxidesynthasetrafficinducer,NOSTRIN)基因的真核表达载体，通过质粒用NOSTRIN真核表达载体转染人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells,HUVEC)获得高表达NOSTRIN基因的细胞克隆。 方法:以质粒pcDNA3.1为载体，将NOSTRINcDNA插入后得到NOSTRIN真核表达载体。采用脂质体介导将重组质粒导入体外培养的HUVEC，Westernblot检测转染细胞和未转染细胞中NOSTRIN蛋白质的表达。 结果:酶切电泳和基因测序证实，成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-NOSTRIN。并用脂质体介导的方法获得了高稳定表达NOSTRIN的细胞克隆；Westernblot显示转染前后的细胞均有58KD的蛋白质表达，转染后表达量明显增高。 结论:重组质粒pcDNA3.1-NOSTRIN经转染能在HUVEC细胞中高效表达，为进一步研究NOSTRIN对HUVEC的生物学影响奠定了基础。 第三部分NOSTRIN基因高表达诱导脐静脉内皮细胞生物活性改变的研究 目的:研究人内皮型一氧化氮合酶运输介导物(endothelialnitricoxidesynthasetrafficinducer,NOSTRIN)基因在体外培养的人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells，HUVEC)中的过度表达对该细胞生物学特性的影响。 方法:脂质体法将pcDNA3.1-NOSTRIN真核表达载体及空载体分别转染体外培养的HUVEC，并设未转染细胞为对照组，G418筛选阳性克隆。免疫组织化学法检测NOSTRIN的表达部位及FⅧRAg的表达；Westernblot检测上述处理细胞中NOSTRIN和eNOS蛋白质的表达；分光光度法和硝酸还原酶法分别测定细胞培养上清中eNOS的活性和NO代谢产物亚硝酸基/亚硝基(NO2-/NO3-)水平；光镜、电镜观察细胞的形态和超微结构。 结果:免疫组织化学证实转染前后细胞均为血管内皮来源细胞，三组均在细胞膜和胞浆表达NOSTRIN；Westernblot显示细胞转染前后均表达58KD的NOSTRIN，但转染pcDNA3.1-NOSTRIN后表达量明显增高，同时也均有145KD的eNOS蛋白质表达，表达量无差异(P＞0.05)；转染pcDNA3.1-NOSTRIN细胞培养上清eNOS活性(11.727±3.09U/ml)与未转染细胞(22.69±3.36U/ml)和对照组细胞(21.85±3.47U/ml)比较降低显著(P＜0.01)，同时转染pcDNA3.1-NOSTRIN细胞培养上清中NO2-/NO3-为(25.56±2.49μmol/l)，与未转染细胞(48.37±2.61μmol/l)和对照组(49.06±2.78μmol/l)比较显著降低(P＜0.01)；光镜和电镜观察看到转染NOSTRIN后对HUVEC有损伤作用(HUVEC拉长、微绒毛变短、细胞膜损伤，胞浆内有脂滴空泡，核膜不完整)。 结论:NOSTRIN的高表达影响了HUVEC的生物学特性，对HUVEC有明显的损伤作用，这可能是妊娠期高血压疾病发病重要环节之一。 第四部分TNF-a上调人脐静脉内皮细胞中NOSTRIN基因的表达 目的:探讨肿瘤坏死因子-a(TNF-a)对人脐静脉内皮细胞中内皮型一氧化氮合酶运输介导物(NOSTRIN)基因表达的调控作用。 方法:将培养的内皮细胞分为3组：1组为用妊娠期高血压疾病患者(HDCP)血清作用的脐静脉内皮细胞，2组为用正常晚孕妇女血清作用的脐静脉内皮细胞，3组为无任何处理的HUVEC。用逆转录－聚合酶链反应检测两组细胞中NOSTRINmRNA的表达。酶联免疫吸附实验(ELISA)检测HDCP患者和正常孕妇血清中TNF-a含量。用1ng/ml、3ng/ml、5ng/ml3种浓度的TNF-a分别作用HUVEC细胞株6h，以及用浓度为3ng/ml的TNF-a作用HUVEC细胞分别长达6h、12h、24h，逆转录－聚合酶链反应(RT-PCR)检测NOSTRINmRNA的表达；将二硫代氨基甲酸吡硌烷(PDTC，5mmol/ml)与TNF-a(3ng/ml)同时作用以及TNF-a(3ng/ml)单独作用HUVEC细胞6h，RT-PCR检测NOSTRIN基因mRNA的表达。 结果:三组细胞中都有NOSTRIN表达，1组表达量显著高于2组和3组(P＜0.01)。ELISA结果显示，HDCP患者血清中TNF-a含量显著高于正常晚孕妇女(P＜0.01)。TNF-a作用HUVEC细胞后NOSTRIN表达显著高表达，并成时间和剂量依赖关系(P＜0.01)。PDTC和TNF-a同时作用的HUVEC和TNF-a单独作用的HUVEC相比，其NOSTRIN表达显著减低(P＜0.01)。 结论:TNF-a可上调NOSTRIN在HUVEC中的表达，PDTC可抑制TNF-a诱导的NOSTRIN表达的上调。用PTDC拮抗NOSTRIN基因的表达将是预防和治疗妊娠期高血压疾病一个新的思路。