【摘 要】
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随着转基因技术的高速发展，转基因动物的安全性越来越受到人们的关注，应用φC31整合酶介导外源基因能以高效整合、定向整合、持续高表达等特点制备转基因动物。近年来已经相继在人、牛、大鼠、小鼠、果蝇、斑马鱼等中发现φC31整合酶介导外源基因定点整合到未被修饰基因组中。目前，有关在山羊中是否φC31整合酶介导外源基因高效整合以及山羊基因组中是否存在假attp序列的相关研究还未见报道，本实验通过检测山羊基因
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随着转基因技术的高速发展，转基因动物的安全性越来越受到人们的关注，应用φC31整合酶介导外源基因能以高效整合、定向整合、持续高表达等特点制备转基因动物。近年来已经相继在人、牛、大鼠、小鼠、果蝇、斑马鱼等中发现φC31整合酶介导外源基因定点整合到未被修饰基因组中。目前，有关在山羊中是否φC31整合酶介导外源基因高效整合以及山羊基因组中是否存在假attp序列的相关研究还未见报道，本实验通过检测山羊基因组中的假attP位点，绘制整合图谱，从中挑选出物种特异性的、整合频率高、表达水平高的整合位点用作制备转基因山羊。实验结果如下：1.构建链霉菌属噬菌体φC31整合酶表达系统：本实验主要构建了链霉菌属噬菌体φC31整合酶融合表达载体pCMV-myc-φC31。通过电转染山羊胎儿成纤维细胞，收集并提取蛋白，经过Western Blotting，检测φC31整合酶在山羊胎儿成纤维细胞中的真核表达。结果表明：φC31整合酶蛋白与myc标签融合片段大小为70.4KD，证明了φc31整合酶能够在山羊胎儿成纤维细胞中表达。2.报告系统和整合酶系统的构建：本实验通过多重PCR扩增，酶切、连接和转化构建pEGFP-C1-attB报告载体和pCMV-φC31-int，pCMV-φC31-NLS-int，pCMV-φC31-3NLS-int整合酶表达载体。3.细胞筛选：本实验通过将已构建的pEGFP-C1-attB报告载体和pCMV-φC31-int，pCMV-φC31-NLS-int，pCMV-φC31-3NLS-int表达载体电转染山羊胎儿成纤维细胞，经过G418筛选获得稳定转染的转基因细胞系。提取山羊胎儿成纤维细胞单克隆中基因组，通过PCR检测attB序列是否断裂，以此来排除随机整合。检测attB序列结果表明：部分单克隆为随机整合，少许单克隆发生了定点整合。4.假attp位点的鉴定与分析：φC31整合酶介导的是一种单向的定点整合，它以非随机整合的形式整合入attP或pseudo attP位点，但是具体整合到某个位点是不确定的。本实验设计选用当下最流行的染色体步移技术来研究已知序列相邻的未知序列，检测山羊基因组中的pseudo attP位点。本实验根据已知pEGFP-C1-attB报告载体序列，分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物SP1，SP2，SP3。与TAIL-PCR试剂盒中提供的四种经过独特设计的退火温度较低的兼并引物进行热不对称PCR。将所得片段与山羊基因组数据库进行比对分析。实验结果显示其中一个假attp整合位点CpsF1位于山羊4号染色体上，其发生频率为3％（3/100），另一个假attp整合位点CpsM1位于山羊5号染色体上，其发生频率为2％（2/100）。以牛做对照，发现在牛上φC31整合酶介导的定点整合到假attp位点的效率要远远高于在山羊基因组中。φC31整合酶介导的外源基因整合到山羊基因组上的效率较低，可能是由于与细胞内某些蛋白发生相互作用，从而抑制了φC31整合酶的活性，如DAXX蛋白等。
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