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第一部分HPV16 E6、IL-28B基因在真核表达载体的构建目的:应用克隆技术将人乳头瘤病毒16的E6、IL-28B基因序列构建于真核表达载体毕赤酵母系统上,进一步筛选和优化,用甲醇诱导表达其蛋白,为宫颈癌的免疫治疗提供基础。方法:在geneback库中找到E6和IL-28B的cDNA序列,实验室前期构建在原核表达载体的E6及IL-28B与基因库查找序列一致。购买Ppic-9k-his质粒,公司提供序列与基因库中比对结果一致,选择EcoRⅠ和NoTⅠ酶切位点,用primer软件设计引物,PCR等分子克隆技术将E6及IL-28B的cDNA序列构建在真核表达载体质粒pPIC9K-his上,转化GS115宿主菌,用G418抗生素筛选出高拷贝菌,优化表达条件。结果:通过分子克隆技术成功构建了毕赤酵母表达载体Ppic9k-his-E6、pPIC9K-his-IL-28B,通过G418筛选出多拷贝转化子,通过优化不同的诱导表达条件,摸索了外源基因IL-28B、E6在毕赤酵母受体细胞的表达,其诱导条件需要进一步的改进,为进一步研究宫颈癌免疫治疗和治疗性疫苗做了准备。结论:成功构建了pPIC9K-his-E6、pPIC9K-his-IL-28B酵母重组质粒,筛选出多拷贝子。第二部分糖酵解抑制剂抗宫颈癌作用的研究目的:通过体外实验观察糖酵解抑制剂3-BrPA、2-DG、氯尼达明对宫颈癌TC-1细胞的抑制作用,筛选出抑制作用明显的糖酵解抑制剂,联合化疗药物顺铂,观察其对小鼠TC-1宫颈癌移植瘤的抗肿瘤作用、乳酸水平的影响,为进一步研究糖酵解抑制剂抗宫颈癌作用提供实验依据。方法:(1)培养小鼠TC-1宫颈癌细胞;(2)通过CCK8、划痕实验、平板克隆实验评价糖酵解抑制剂对宫颈癌TC-1细胞的抑制作用;(3)建立C57小鼠皮下移植瘤模型;(4)待皮下移植瘤直径达3mm,用随机数字表对实验小鼠进行完全随机分成6组,包括3-BrPA、2-DG、3-BrPA+顺铂、2-DG+顺铂、顺铂及PBS组,观察移植瘤的大小变化,并计算其抑瘤率;(5)21天后通过眼球取血将各组实验小鼠的血清进行离心,通过酶标法检测血清中的乳酸变化情况。结果:(1)在增殖实验中发现3-BrPA、2-DG、氯尼达明对宫颈癌TC-1细胞分别作用24h、48h、72h后,随着药物浓度的增大,其生长抑制率也呈增高的趋势。镜下观察3-BrPA、2-DG、氯尼达明组细胞数量减少,联合顺铂组比单用顺铂组细胞量更少,3-BrPA、2-DG、氯尼达明组发生形态发生变化,细胞变圆变小,出现核固缩。(2)在划痕实验中,24h平均迁移率顺铂(4.35±0.69%)<3-BrPA(16.26%±0.018%)<2-DG(18%±0.57%)<氯尼达明(21.26%±2.08%)<PBS(28.81±1.1%)(P<0.05);48h平均迁移率顺铂(10.23%±0.7%)<3-BrPA(26.95%±1.32%)<2-DG(30.68%±1.10%)<氯尼达明(36.18%±3.70%)<PBS(39.80%±2.1%)(P<0.05);(3)在平板克隆实验中,克隆形成率顺铂(7.6±0.37%)<3-BrPA(17.13%±0.59%)<2-DG(23.04±0.82%)<氯尼达明(33.62±0.26%)<PBS(57.4%±0.27%)(P<0.05)。(4)成功建立了实验小鼠皮下移植瘤模型。其抑瘤率3-BrPA+顺铂(91.30±1.24%)>2-DG+顺铂(86.50±0.38%)>顺铂(78.36±1.28%)>3-BrPA(71.27±0.93%)>2-DG(65.44±1.74%)>PBS(0)(P<0.05);乳酸含量检测实验中,发现3-BrPA、2-DG组、顺铂联合组与PBS组有显著差异(P<0.05);3-BrPA、2-DG组、顺铂联合组与单独使用顺铂组有显著差异(P<0.05)。结论:(1)在体外实验中发现糖酵解抑制剂对宫颈癌细胞增殖、迁移能力的抑制作用3-BrPA>2-DG>氯尼达明。(2)在体内实验中发现抗肿瘤作用3-BrPA+顺铂>3-BrPA>2-DG,3-BrPA、2-DG可以降低糖酵解速率,使小鼠血清中乳酸含量下降,3-BrPA对宫颈癌细胞抗肿瘤作用最强。