论文部分内容阅读
硒蛋白是生物体内通过终止密码子之一的UGA编码的一种特异蛋白质,已经阐明生物功能的硒蛋白在生物体内都有重要的生理功能。果蝇硒蛋白dSelK是果蝇体内已知的三种硒蛋白之一,并且是唯一一种位于内质网中的硒蛋白,阐明其生物功能对于研究动物的生理代谢具有重要作用。本课题组在前期研究中通过基因芯片检测发现当果蝇细胞Schneider 2(S2)的dSelK通过dsRNAi敲减后位于内质网上与钙离子转运相关的Inositol 1,4,5,-tris-phosphate receptor (IP3 receptor)的表达量发生显著的降低,而和其功能相反的位于细胞浆中的Inositol 1,4,5,-tris-phosphate Kinase1 ( IP3 Kinase1)的表达量发生显著升高,由此初步推测dSelK可能与内质网内中钙离子的释放有关。本实验首先通过实时定量PCR对于前期所进行的基因芯片检测结果进行了验证。然后利用dsRNAi对果蝇细胞S2细胞中dSelK的mRNA进行敲减,对dSelK敲减获得果蝇S2细胞浆中游离钙离子浓度的变化情况用钙离子荧光探针Fluo-3/AM和激光共聚焦显微镜进行了检测,同时构建dSelK与红色荧光蛋白dsRed融合蛋白的表达质粒pAC-dSelK-dsRed-N1,并将其在果蝇S2细胞中表达,利用钙离子荧光探针Fluo-3/AM和激光共聚焦显微镜对胞浆内游离钙离子的变化情况进行了检测。通过Hoechest染色等方法对dSelK过表达时细胞凋亡的情况进行研究。实时定量PCR研究表明,当果蝇细胞中dSelK的mRNA被dsRNAi敲减后,位于内质网上促进内质网中钙离子向细胞浆中释放的IP3 receptor的表达量显著下降,而位于细胞浆中与IP3 Receptor功能相反的IP3 Kinase1的表达量显著升高,进一步证实了本课题组前期基因芯片检测的研究结果。对dsRNAi后果蝇S2细胞浆中游离钙离子的研究发现,在dSelK的mRNA被dsRNAi敲减后细胞浆中的钙离子浓度显著降低。对dSelK-dsRed融合蛋白过表达的果蝇S2细胞浆中游离钙离子浓度的研究发现,在dSelK过表达后,果蝇细胞浆中的钙离子浓度与空白对照正常细胞相比显著升高,而其阴性对照内质网结构蛋白PDI过表达的细胞胞浆中的钙离子浓度没有明显变化。通过Hoechest等进行的细胞凋亡检测没有在dSelK的过表达果蝇S2细胞中发现凋亡现象。综上所述,本实验通过对dsRNAi基因敲减果蝇S2细胞和dSelK过表达果蝇S2细胞浆中钙离子浓度变化的测定首次发现果蝇硒蛋白dSelK能够通过控制位于内质网中的钙离子向细胞浆中的释放,并且这种释放有可能是通过提高位于内质网上的IP3 Receptor的表达而实现的。上述研究对于揭示其人体内同源基因人硒蛋白SelK及生物体中其他硒蛋白的生物功能具有重要的指导意义。