人类生存的环境中存在大量的病原微生物——病毒、细菌、真菌、原生动物和寄生虫，而机体在这样的环境中能够抵御这些病原体的侵扰并维持自身稳定，在很大程度上依赖于机体的免疫系统。无论是天然免疫系统还是获得性免疫系统，在机体的抗感染免疫中都起到至关重要的作用，其中，Tol l 样受体（Toll-like receptors, TLRs）以及TLR 触发的天然免疫应答反应是免疫系统识别和清除病原体极为重要的机制。作为最重要的一类模式识别受体(Pattern recognition receptors, PRRs)，TLRs 主要表达于巨噬细胞和树突状细胞 (Dendritic cells, DC)表面，在各种生物体内高度保守，能够选择性的识别病原体相关分子模式(Pathogen associated molecular patterns, PAMPs)，构成机体免疫系统抵御病原体入侵的第一道防线。为了更好的达到有效清除病原体而同时又不因过度的炎症反应导致机体免疫损伤，TLR信号通路又受到多种其它分子和信号通路的精密调控，但目前对于TLR信号通路调控的细胞与分子机制的研究尚不完全明了，有待于进一步深入研究。对天然免疫信号调控网络的研究对于全面认识免疫系统和抗御外界病原体侵袭具有重要的理论意义和应用价值。　　 MHC I 类分子在免疫系统的发育和功能中起着重要的作用，其经典功能是在内质网结合9-11个氨基酸的短肽，然后转运到膜表面，将此短肽抗原通过TCR 递呈给CD8+T细胞。 MHC I 类分子的缺失会影响CD8++T细胞在胸腺的阳性选择，导致CD8 T细胞发育障碍。近年来一些研究表明MHC I 类分子还具备非经典功能，尤其在交联MHC I类分子后能够在特定细胞介导逆向传递信号，触发一定的生物学效应，包括细胞增殖、凋亡、活化等。考虑到MHC I 类分子在几乎所有有核细胞表面都有不同程度表达，它的表达或者激活的逆向信号对于TLR 配体触发的巨噬细胞天然免疫反应具备怎样的调控作用？目前尚不清楚。（问题1）　　 MHC I 类分子的异常表达对于自身免疫性肌炎（autoimmune myositis）、I 型糖尿病以及炎性肠病等一些自身免疫性疾病的发生起到关键作用，而近年来Th17细胞被认为参与多种自身免疫性疾病的发生，这两者之间是否存在一定的关联还未有报道。　　 白细胞介素17 （interleukin 17, IL-17）作为Th17细胞最重要的功能因子能否导致MHC I 类分子的表达异常，抑或MHC I 类分子的表达异常导致了IL-17的分泌增多？　　 目前尚不明确（问题2）+MHC I 类分子的经典功能主要包括递呈抗原以激活CD8 T细胞，以及通过抑制性NK 受体维持NK细胞的自身耐受。如若IL-17能够调节MHC I 类分子的表达，这就提示我们很有可能IL-17对于机体CD8+T细胞和NK细胞的正常功能具备一定的调控效应。以往对于IL-17的研究局限在对于天然免疫系统的中性粒细胞的募集和趋化，对IL-17 非经典功能的研究将有助于我们更加全面的认识机体抗感染免疫精细的调控网络。　　 +T细胞是机体获得性免疫的重要组成部分，而CD8 T细胞更是机体抵御胞内菌和病毒感染以及杀伤突变肿瘤细胞的主要效应细胞，其免疫应答的强弱直接关系到机体的健康状态。CD8+T细胞的激活首先需要相应的抗原递呈细胞MHC I 类分子提供第一信号，而这些APC 本身表达的一些共刺激分子如CD80、CD86等提供第二信号，共同触发CTL的活化和增殖。在固有免疫中，IL-17 可以通过促进CXC家族趋化因子（如CXCL8，CXCL1，CXCL10等）以及细胞因子（如IL-6,GM-CSF等）分泌，趋化并激活中性粒细胞从而发挥保护作用。近来有研究表明IL-17在DTH反应和Th1细胞导致的IBD中发挥作用，暗示其很有可能也参与到获得性免疫应答，然而IL-17对于获得性CD8+T细胞免疫应答到底具有怎样的调控作用？MHC I类分子在其中发挥怎样的功能以及在感染情况下IL-17的细胞来源是什么？目前尚未见报道（问题3）。　　 +机体内MHC I 类分子的天然配体主要为NK细胞表面的抑制性受体，以及CD8 T细胞表面的CD8/TCR分子。在体内利用单克隆抗体剔除了CD8+T细胞或者NK细胞都能够使得机体对TLR 配体的反应性增强。在体外，在巨噬细胞培养体系中加入CD8+T细胞，能够明显抑制TLR 配体触发的应答，而加入NK细胞未见此效果。用Transwell隔开T细胞和巨噬细胞后，此抑制作用消失，同样CD8+T细胞对MHC I 缺失的巨噬细胞却没有抑制效应，提示T细胞发挥抑制效应是接触必须的而且依赖于巨噬细胞表面的MHC I 类分子。采用MHC I 类分子抗体交联腹腔巨噬细胞，在体外模拟MHC I 类分子逆向信号，能够下调TLR 配体触发的炎性因子TNF、IL-6和I 型干扰素的分泌。WB结果也证实NF-κ B和IRF3信号通路受到抑制，Erk、Jnk和p38 磷酸化也同样减弱。我们推测在TLR 配体活化的巨噬细胞，其表面MHC I 类分子在被CD8+T细胞交联后，能够招募活化胞膜或者内侧的抑制性受体，从而介导了对TLR通路的负向调控作用，但具体是什么受体以及在MHC I 类分子仅有很短的胞内段的情况下这种效应是如何发生的还有待进一步研究。　　 +至此，我们发现MHC I 类分子在与CD8 T细胞相互作用后，MHC I 类分子的逆向信号能够负向调控TLR 配体诱导巨噬细胞的活化，使机体炎症反应局限在一定的范围内，从而避免对机体造成严重的病理损伤。在李斯特菌感染后能够诱导一群特定的γδ T细胞分泌IL-17。　　 IL-17通过作用于树突状细胞，促进其交叉提呈能力，从而激发更为强烈的杀伤性T细胞反应，在机体抗李斯特菌感染的免疫反应中发挥重要作用。对抗肿瘤生物治疗也存在一定指导意义。白细胞介素17对NK细胞介导的肝炎的调控作用及机制在人类肝炎血清中检测到IL-17的上升，并且与疾病严重程度呈正比，提示IL-17在病毒性肝炎中的致病作用。我们采用PolyI:C 联合D-galN 诱导的急性肝炎为模型，发现Il17a-/-小鼠的存活能力要远远高于野生对照，与其对应的是血清中较低的谷丙转氨酶和谷草转氨酶，病理结果也证实野生小鼠肝脏细胞空泡形成和凋亡要比缺陷小鼠明显。通过对两种小鼠肝脏浸润淋巴细胞分析，我们发现Il17a-/-小鼠中NK细胞在肝脏的聚集明显受到抑制，而且即使是募集来的NK细胞其活化性标记CD69的表达也远远低于野生对照。体外研究发现，NK细胞也表达IL-17RA，但是IL-17信号对NK细胞的存活并没有影响，也不能活化NK细胞，但是能够协同PolyI:C 激活下游NF-κ B 转录因子，以及MAPK信号通路，使得NK细胞对YAC-1和原代肝细胞杀伤能力增强，从而可能解释在IL-17 存在的情况下PolyI:C 激发的肝炎要更加严重。利用细胞因子胞内染色技术，我们发现PolyI:C 诱导肝炎过程中，肝脏中IL-17的主要来源是γδ T细胞和NKT细胞。同样，我们也检测了Kupffer细胞在其中的作用，利用脂质体或者Gdcl3 剔除肝脏Kupffer后，再注射PolyI:C，发现血清中IL-17水平明显下降，提示巨噬细胞参与IL-17的诱导产生和肝炎发生。PolyI:C 可以刺激巨噬细胞分泌细胞因子IL-1、IL-23等，这些细胞因子能够促使γδ T细胞分泌IL-17，继而影响了NK细胞的活化。过继回输野生型的γδ T细胞到Il17a-/-小鼠体内，能够一定程度上加重肝脏损伤。　　 我们的研究表明，PolyI:C 或者病毒感染机体后，在通过TLR3 活化NK细胞的同时，能够诱导肝脏中的固有免疫γδ T和NKT细胞分泌IL-17，协同增强NK细胞活化，加重NK对肝细胞的毒性作用，从而加重肝损伤。Kupffer 可能也通过分泌相关细胞因子参与了γδ T细胞IL-17 诱导这一过程。此发现有助于阐明病毒性肝炎重症化的机制及免疫调控新方法的建立有重要意义。　　 +总之，通过以上四部分实验内容，我们研究了CD8 T细胞通过MHC I 类分子调控TLR 激发的巨噬细胞应答及其机制，以及天然免疫细胞分泌的IL-17对CD8+T细胞和NK细胞的调控，证明了IL-17对天然免疫和获得性免疫的促进作用，同时也发现获得性免疫的CD8+T细胞可以通过MHC I 逆向信号影响天然免疫应答。该研究结果拓宽了人们对于MHC I 类分子以及IL-17的性质与功能的认识，丰富了TLR免疫识别及其调控机制的研究内容，也有望为免疫相关疾病发病机制的研究与治疗方法的寻找提供新的启示。