研究背景乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)简称乙肝病毒,是一种小环型部分双链DNA病毒,其基因组至少包含S(包含S基因、PreS1基因和PreS2基因)、C、X、P等4个开放读码框架,分别编码包膜抗原(HBs)、核心蛋白(HBc)、X蛋白(HBx)和DNA聚合酶。HBV属于嗜肝病毒属,但没有直接的肝细胞毒性,病毒感染后引发的免疫性肝损伤是其致病的重要机制,HBV感染后可进一步导致肝硬化或肝细胞肝癌的发生。据统计,目前全世界HBV感染人数已超过4亿,每年约100余万人死于HBV相关肝病,因HBV相关疾病死亡的人数占全球40%左右,因此,HBV是目前危害人类健康的主要杀手之一,但HBV感染致免疫性肝损伤的作用尚不十分清楚,其致病机制亟待于深入探讨。长期以来,多数学者认为HBV的成功清除与体内较强的特异性细胞免疫应答有关,然而,越来越多的证据表明固有免疫在HBV感染及致病过程中发挥重要作用,明确HBV感染引发的免疫效应及分子机制对于HBV相关肝病的诊断和治疗极为关键。研究发现,HBV感染后是由肝脏非实质细胞识别,主要由枯否氏细胞(Kupffer cell,KC)识别。KC是肝脏中定居的巨噬细胞,占全身巨噬细胞总数的80%-90%,是体内最大的巨噬细胞群,也是肝内主要的炎性反应细胞和细胞因子来源,KC通过产IL-1β、IL-18等炎症因子参与各种慢性肝病过程中肝损伤的发生与发展。IL-1β和IL-18的产生依赖于炎性体的激活。炎性体(也称炎症小体)是Tschopp等于2002年首次发现并报道的,第-个被发现的炎性体是NLRP1炎性体。随着研究的深入,陆续发现的炎性体有NLRP3(或NALP3).NLRC4.AIM2、RIG-I炎性体等,其中,NLRP3炎性体被研究得最多,NLRP3分子通过接头蛋白ASC招募Caspase-1,从而组成多蛋白复合物即NLRP3炎性体。多种病毒感染可介导NLPR3炎性体的活化,NLRP3炎性体即可感应RNA病毒如流感病毒、丙型肝炎病毒(HCV),也可感应DNA病毒如腺病毒、水痘-带状疱疹病毒,由此说明无包膜的小分子DNA病毒或有包膜的大分子DNA病毒都可调节NLRP3炎性体的活化。炎性体的激活可使Caspase-1活化进而对IL-1β或IL-18前体进行剪切,促进IL-1β或IL-18的成熟和释放,引起炎症反应。文献报道,IL-18、IL-1β启动子基因多态性与HBV感染后的疾病进程及预后密切相关,HBx蛋白和HBc蛋白可诱导IL-18的产生,慢乙肝患者血清中IL-1β的水平显著高于正常人,且乙肝患者体内IL-1β的水平与HBV病毒滴度呈正相关。那么HBV如何调节IL-1β和IL-18的产生呢?目前尚未见相关研究的报道,本文首次探讨了HBV对NLRP3炎性体的调节作用。T细胞免疫球蛋白域黏蛋白样蛋白(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain, Tim)家族是McIntire于2001年发现并鉴定的与哮喘和过敏性疾病相关的一个新基因家族。小鼠Tim基因家族位于染色体11B1.1,目前共发现8个基因,编码蛋白Tim-l-Tim-4和4个假想基因Tim-5-Tim-8。人类TIM家族只有3个基因,定位于染色体5q33.2,分别编码蛋白TIM-1、TIM-3、TIM-4。Tim蛋白是一类具有共同基序的Ⅰ型跨膜糖蛋白,其结构包括免疫球蛋白(IgV)样区、黏蛋白(Mucin)样区、跨膜区和胞内区。除Tim-4外,Tim-1、Tim-2、Tim-3胞内区均含有酪氨酸激酶磷酸化位点,直接参与胞内信号转导。Tim-4分子在免疫调节及维持机体稳态中具有重要作用。Tim-4是Tim-1的天然配体,主要表达在活化的抗原提呈细胞表面,能维持腹腔巨噬细胞平衡,Tim-4与Tim-1相互作用可为T细胞提供协同刺激信号,Tim-4对T细胞的活化具有双重调控作用,而Tm-4对巨噬细胞具有负调控作用。课题组前期研究发现,Tim-4过表达可抑制LPS诱导的IL-1β产生,在ConA诱导的小鼠肝炎模型中,发现转输Tim-4过表达的巨噬细胞系可抑制IL-1β的产生,提示Tim-4可能抑制炎性体的活化。另外,发现慢乙肝患者PBMCs、HBV转基因小鼠肝单个核细胞中Tim-4的表达水平显著减低,那么HBV如何调节Tim-4的表达,是否通过调节其启动子活性进而影响其表达呢?HBV是否通过调节Tim-4的表达影响NLRP3炎性体的活性呢?本文基于相关问题进行了初步探讨。研究目的明确HBV对NLRP3炎性体活性的影响,并初步探讨其作用机制；构建人TIM-4启动子报告基因载体并鉴定其活性；探讨TIM-4对NLRP3炎性体活性的影响。方法第一部分：HBV对NLRP3炎性体活化的影响1临床标本检测(1)收集慢乙肝患者及健康对照血浆标本收集了56例慢乙肝患者的初诊病人和20例健康对照组的肝素抗凝血，离心取取上清,-20℃保存。(2)ELISA检测血浆中IL-1β的水平利用ELISA试剂盒检测初诊的慢乙肝病人以及健康对照组的血浆中IL-1β的水平。2.动物实验(1)H3V转基因小鼠及正常对照取鉴定为阳性的8-12周龄的HBV转基因小鼠(Balb/c)35只,以及由山东大学动物中心提供的,12只同龄Balb/c小鼠为正常对照。(2)HBV转基因小鼠血清DNA及抗原的检测分批处死HBV转基因小鼠,摘眼球取血，温放置2h,4℃离心收取上清,检测HBV DNA及表面抗原。(3)ELISA检测血清中IL-1β的水平用ELISA试剂合检测HBV转基因小鼠与健康对照鼠血清中的IL-1β(4) Western blot检测小鼠肝组织中Caspase-1的活化随机选取14例HBV转基因小鼠及珔常对照小鼠的肝组织,取米粒大小的肝组织,匀浆并提取蛋白,Western blot检测Caspase-1的活化情况。3.细胞模型(1) Caspase-1、ASC、NLRP3siRNA的筛选与鉴定分别设计并合成了人ASC、caspase-1、NLRP3三个基因的小干扰套餐,在HEK293细胞中用质粒DNA与小干扰用脂质体法共转,转染48h后,收取细胞,提蛋白,用Western blot验证干扰效果,选取效果较好的进行后续实验。同时,利用脂质体转染PMA诱导的THP-1细胞,验证以上基因siRNA对内源性基因的干扰效果。(2) HepG2.2.15或HepG2细胞培养上清刺激THP-1细胞常规培养HepG2或HepG2.215细胞(无G418),待细胞铺满培养瓶即将传代时,收取其上清,1.5ml Ep管分装并冻存于-80℃,避免反复冻融。THP-1细胞以4-5×105/m1的密度接种于24孔板,分别加入200μ1的HepG2或HepG2.215细胞培养上清刺激O h、3h、24h或48h,加上清前吸取取出等量的培养基,以保持相同的培养体系。轻轻晃动细胞板混匀,置于37℃、5%C02培养箱孵育24h,离心收取上清及细胞。(3) HepG2.2.15或HepG2细胞与THP-1细胞共培养利用corning transwell小室,THP-1细胞以4×105/ml的密度接种于12孔板下室,HepG2.2.15/HepG2细胞铺于上室。THP-1细胞数目固定,设THP-1/HepG2或HepG2.215细胞分别为1：1、1：2和1：4三个比例,共培养48h后收细胞及上与。(4) ELISA检测IL-1β的水平同上检测上清中IL-1β的水平。(5)细胞免疫荧光观察HBV促NLRP3炎性体的形成HepG2或HepG2.215细胞培养上清刺激48h后,收集细胞,以4%多聚甲醛固定,以兔抗人Caspase-1、NLRP3(?)单克隆抗体为-抗、Cy3标记的羊抗兔IgG为二抗进行免疫荧光染色,荧光显微镜观察红色荧光,拍照保存。4.NLRP3炎性体重构实验(1) NLRP3炎性体重构体系的建立参考文献建立NLRP3炎性体重构系统,将HEK293细胞、HepG2、HeLa、Huh7细胞分别接种于24孔培养板,利用Lipofectin2000共转染以下质粒DNA,质粒及其用量分别为：pDsRed-monomer-C1-human ASC5ng、 pDsRed-monomer-C1-human caspase-15ng、 pCR4-TOPO-human NLRP315ng、 pDsRed-monomer-C1-human IL-lbeta150ng,混匀后共转细胞,转染前将细胞的培养基换成无血清培养基,转染5-6h换成含血清的培养基。48h后收取细胞及其上清,ELISA检测上清中IL-1β,提取蛋白Western blot检测Caspase-1的活化情况。(2)HBV质粒DNA与NLRP3炎性体共转在HEK293、HepG2、HeLa、Huh7细胞中分别进行共转染,NLRPP3炎性体组分质粒DNA(?)用量同上,分别同时转入pcDNA3.0或pcDNA3.0-HBV1.1质粒DNA600ng,转染48h后收取细胞及其上清。(3) ELISA检测IL-1β的水平收取细胞上清,用eBioscience公司的human IL-1β ELISA试剂盒检测IL-1β。(4) Western blot检测Caspase-1的活化24孔板转染细胞24h后,收细胞,提取取蛋白,Western blot(?)检测Caspase-1的活化情况。(5)ASC表达载体的构建及过表达稳筛细胞系的建立a.构建真核载体pc3-hASC-HA,以pDsRed-monomer-C1-hASC载体为模板,以加了HA标签的下游引物来扩增hASC-HA基因片段,双酶切后连入pcDNA3.0载体。经测序并比对无误后的的重组载体经Western Blot验证。b. HEK293细胞最佳G418的筛选浓度：将HEK293细胞稀释到1000个细胞/ml,分别加入G418,使其终浓度为400μg/ml、600μg/ml、800μ g/ml、1000μ g/ml,隔1-2天换含相同G418浓度的培养基,两至三周后观察结果,HEK293细胞全部死亡的最低G418浓度即为最佳筛选浓度。建立ASC过表达稳筛细胞系：HEK293细胞铺板后,脂质体法转染pDsRed-monomer-C1-human ASC,转染48h后换成含800μ g/ml G418的培养基,隔1-2天换液。稳筛两周后,荧光显微镜观察,提取蛋白Western blot检测ASC的表达。(6)共培养体系验证HBV可能通过Racl激活NLRP3炎性体THP-1细胞以4×105/ml的密度种板,用320nMPMA(12-16h)诱导成巨噬细胞后,Racl小干扰干扰24h后,再与HepG2.2.15细胞共培养48h后ELISA检测培养上清中的IL-1β水平。第二部分：人TIM-4启动子报告基因载体的构建及检测(1)人TIM-4启动子系列载体的构建利用软件预测并分析了人TIM-4基因的启动子-1887/+65,并根据转录因子结合位点设计系列截短的启动子。以健康人外周血PBMC基因组DNA为模板,利用高保真酶PCR扩增出人TIM-4基因启动子区域-1887至+65(转录起始位点为+1)片段,胶回收PCR产物连T载体,蓝白斑筛选等鉴定阳性克隆,经Sac Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切连入经相同酶切的pGL3载体,转化、涂板、双酶切、测序鉴定阳性克隆。以载体pGL3-human PTIM4(-1887/+65)为模板,构建-1682/+65、-1307/+65、-1162/+65、-887A65、-662/+B5、-392/+65、-162/+65、-42/+65等截短的启动子。(2)启动子活性检测双荧光素酶法检测分析报告质粒人TIM-4启动子的活性。A549细胞以2×10。个/ml的密度铺于48孔板,以聃动子质粒DNA500ng/孔、pGL-TK10ng/孔利用脂质体法转染细胞,转染后48h,吸掉培养基,PBS洗三遍,以1×PBL细胞裂解液彻底裂解细胞,用荧光计数仪检测启动子的荧光素酶活性与内参pGL-TKRenilla荧光素酶活性,比较其ratio值。每次实验设3复孔,取取平均值。第三部分：TIM-4对NLRP3炎性体活性的影响(1) NLRP3炎性体重构同上重构NLRP3炎性体,利用脂质体法分别同时转入pcDNA3.0或pcDNA3.0-TIM-4600ng,转染48h后收细胞及其上清,检测IL-1p的水平。(2)小鼠TIM-4系列表达载体的构建与鉴定构建小鼠TIM-4全长及不同结构域缺失的系列载体：pEGFP-Mtim-4(full length)、pEGFP-mTIM-4(ΔC)(胞内区缺失)、pEGFP-mTIM-4(ΔTC)(跨膜区和胞内区缺失)、pEGFP-mTIM-4(ΔTC)-DAF(跨膜区以人DAF膜区代替),分别以PCR、酶切、测序鉴定序列的正确性。转染CHO细胞,荧光显微镜观察荧光表达情况。结果第一部分：HBV对NLRP3炎性体活化的影响1.HBV感染导致IL-1β升高慢乙肝患者(初诊)及HBV转基因小鼠外周血中IL-1β水平显著高于正常对照(p<0.05),但并未发现其与HBV DNA及抗原的相关性。2.HBV促单核/巨噬细胞产生IL-1β共培养实验结果表明随着HepG2.2.15细胞数目的减少,IL-1β的产生也随之降低。HepG2细胞或HepG2.2.15上清处理THP-1细胞,结果发现含HBV上清呈时间依赖性刺激IL-1β的产生,HepG2.2.15细胞上清也可显著刺激RAW264.7细胞产生IL-1β。3.HBV促单核/巨噬细胞产生IL-1β依赖于Caspase-1THP-1细胞用Caspase-1抑制剂处1-1.5h后,进行IIcpG2.2.15上清处理48h,结果发现Caspase-1抑制剂处理组IL-1β水平显著低于DMSO对照组。4.HBV促IL-1β产生是通过NLRP3炎性体发挥作用4.1验证小干扰效果利用质粒DNA或siRNA共转染HEK293细胞、siRNA转染THP-1细胞,Western blot检测验证Caspase-1、ASC、NLRP3siRNA的干扰效果,结果显示siNLRP3-978、2545可显著抑制NLRP3蛋白的表达；siASC-217、397、499均具有干扰效果；siCaspase-1-788、1094于扰效果较好。4.2NLRP3在HBV诱导的IL-1β产生中发挥重要作用THP-1细胞(5×105ml)接种于12孔培养板,以终浓度为320nmol/ml的PMA诱导12-16h贴壁,转染前换成无血清的培养基,用Lipo2000转siNLRP3-9785μ1/孔,6-8h换成含10%血清的培养基,干扰24h后,加入HepG2.2.15细胞与之共培养48h收细胞及其上清,结果表明：与对照组相比,干扰NLRP3后HBV诱导的IL-1β水平显著降低。5. HBV促进NLRP3炎症小体组装5.1NLRP3炎性体重构：参考相关文献,利用K293/HepG2/Hela/Huh7细胞重构NLRP3炎症小体。实验结果显示：共转染pcDNA3-HBV1.1可显著促进IL-1β的产生,与对照组相比,Western blot检测结果显示HBV可促进Caspase-1的活化。5.2HBV促进NLRP3炎性体的形成：含HBV上清刺激THP-1细胞48h,免疫荧光检测NLRP3、Caspase-1分子的表达,利用荧光显微镜观察,结果显显HBV刺激组表达水平上调。5.3ASC过表达稳筛细胞系的建立：利用HEK293细胞确定G418的有效作用浓度为800μg/ml, pDsRed-express-C1-ASC及空载体pDsRed-express-C1分别转染HEK293细胞,并利用含800μg/mlG418培养基进行筛选,待细胞克隆形成后进行传代,利用荧光显微镜观察发现筛选的细胞呈现红色荧光,Vestern blot可检测到ASC蛋白的表达。5.4真核表达载体pcDNA3.0-human ASC-HA的构建：阳性克隆分别利用PCR及酶切、测序鉴定,PCR可扩增ASC特异性片段,经HindⅢ、Xbal酶切鉴定,测序结果经blast分析序列与genebank提供的人ASC基因序列完全一致。pcDNA3.0-human ASC-HA质粒DNA转染HEK293细胞后,利用HA抗体可检测到其蛋白的表达。6.HBV通过Racl激活NLRP3炎性体THP-1细胞经PMA诱导贴壁,转染Racl siRNA及对照24h,再用含HBV的HepG2.2.15细胞与之共培养48h,ELISA检测结果显示Racl干扰组IL-1β水平低于对照组。第二部分：人TIM-4启动子报告基因载体的构建及检测成功构建人TIM-4启动子报告基因的全长及系列截短载体,启动子活性待验证。第三部分：TIM-4对NLRP3炎性体活性的影响NLRP3炎性体重构体系中,过表达TIM-4可显著抑制IL-1β的产生。成功构建了小鼠TIM-4的不同功能域缺失的载体pEGFP-mTIM4(full length)、 pEGFP-mTIM4(ΔC)、 pEGFP-mTIM4(ΔTC)、 pEGFP-mTIM4(ΔTC)-DAF,转染CHO细胞后,于荧光显微镜下可观察到绿色荧光。结论1.利用慢乙肝病人及HBV转基因小鼠证实HBV可促进IL-1β的产生,提示其产生与炎性体激活有关。2.利用THP-1细胞证实HBV诱导IL-1β的产生依赖于Caspase-1。3.利用THP-1细胞及重构实验证实HBV通过激活NLRP3炎性体诱导IL-1β的产生。4. HBV通过Rac1通路激活NLRP3炎性体。5.TIM-4抑制NLRP3炎性体的活化。创新点及意义本研究首次发现HBV通过激活NLRP3炎性体诱导Caspase-1的活化及IL-1p产生,并发现HBV通过Racl通路激活NLRP3炎性体,另外新型免疫分子TIM-4可抑制NLRP3炎性体的活化。本文研究结果提示HBV感染可能通过激活NLRP3炎性体诱导免疫性肝损伤,为HBV相关肝病的发病机制研究提供了新的思路,并为其临床治疗提供了理论基础。