论文部分内容阅读
微囊藻毒素（MCs）是一类具有生物活性的单环七肽肝毒素，目前已知的异构体超过80余种，其中毒性较强，研究较多的一种便是MC-LR。由于其能够长时间存留在水体中，并能够在生物体内累积，对人类饮水安全和水产养殖行业都提出了挑战。因此，目前的研究较多集中于水体中MC-LR的检测和MC-LR细胞毒性等两方面。凡纳滨对虾作为我国的主要经济水产动物，在养殖过程中常常受到蓝藻水华爆发的影响，水华产生的微囊藻毒素使得对虾大规模死亡，水产行业受到极大的影响。目前已知的研究证明微囊藻毒素可以影响浮萍[1]、大型溞[2]、克氏原螯虾[3]和白鲢[4]等多种水生生物的生理活动，甚至导致死亡。凡纳滨对虾同样作为受到MC直接影响的物种，MC对其造成影响的途径及毒性机理却尚不明晰。本研究通过第二代高通量测序、qRT-PCR等技术手段试图寻找到MC-LR对凡纳滨对虾体液免疫相关基因表达量的影响情况及其致毒机理。在对健康成虾分别注射MC-LR溶液和等量PBS溶液12h后，采集足量的对虾肝胰腺和血液样品，RNA抽提后得到总RNA样品。将样品进行mRNA纯化，分解成小片段，PCR扩增构建文库等一系列操作之后，通过Illumina HiSeq2000高通量测序进行了转录组文库的构建和表达谱分析。在所构建的转录组文库中，共得到转录本30,587条，平均长度为1,402.66bp，GO功能注释后共有7,175条转录本得到了相应的功能注释，可归类到生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component, CC）和分子功能（molecular function, MF）三个二级分类中。通过BLAST软件比对COG和KEGG数据库后发现：共有4,588条转录本在COG数据库中得到了相应注释，5,327条转录本在KOG数据库中得到了相应注释，77条转录本在NOG数据库中得到了注释；共有7,955条转录本在KEGG数据库中得到了注释，分别属于311个已知的信号通路中。表达谱分析结果显示：在肝胰腺中共有880条差异表达的转录本，包含89个差异表达基因，存在表达差异的基因多为抗氧化酶类基因；血液中共有212条差异表达的转录本，包含21个差异表达基因，存在表达差异的基因多为淋巴细胞介导的细胞免疫相关基因。两种组织间表达差异的基因存在明显的不同。同时在肝胰腺中存在极个别显著富集的KEGG PATHWAY通路基因，可造成凡纳滨对虾体内鞘脂类代谢失调，可能是MC导致凡纳滨对虾免疫系统受损，抗病力下降的新途径，值得我们深入探究。在以往的研究中，对虾体液免疫主要包括酚氧化酶原激活系统、凝集素等，而抗菌肽作为一种具有广谱性杀菌效力的生物大分子，近年来得到了越来越多的研究。目前已知的对虾抗菌肽可大致分为三类（Penaeidin、Crustin和ALF），MC诱导情况下抗菌肽基因的表达量变化情况及其抗菌性变化情况尚未人进行研究。本研究通过qRT-PCR技术分析了MC-LR注射后凡纳滨对虾体内Penaeidin3、Crustin、ALF等三种抗菌肽的表达量变化情况，证明了MC-LR诱导下三种抗菌肽的表达量出现了明显的变化，且变化的趋势各不相同。在MC-LR注射8h后再次对凡纳滨对虾注射鳗弧菌后发现，三种抗菌肽基因的表达量均出现了先下调后上调的变化趋势，且在整个实验过程中，MC-LR注射组抗菌肽基因的表达量均略低于对照组，表明MC-LR对其三种抗菌肽基因的表达产生了某种影响，降低了其抗菌肽在抵御外来细菌入侵时的抗菌效力，体液免疫能力受到了影响。