芫花(GenkwaFlos)为瑞香科植物芫花(Daphne genkwa Sieb.etZucc)的干燥花蕾,收载于历版《中国药典》,为传统的泻水逐饮药。芫花生品有毒,临床常用炮制后的饮片入药。本研究以芫花为研究对象,以代谢组学为主要技术手段,结合血清生化和组织病理学的研究方法,对芫花致肝损伤内源性代谢物的变化进行研究,对可能的致肝损伤机理进行初步的阐释,对其致肝损伤作用部位和毒效物质基础进行筛选。应用植物代谢组学方法,对芫花致肝损伤作用部位化学成分在炮制前后的变化进行研究。并应用血清药理和体外细胞试验的方法,对芫花致肝损伤作用部位含药血清和毒性成分进行体外细胞毒性的研究,为阐明芫花致肝损伤机理和炮制减毒机制提供依据。研究内容如下:1.芫花致肝损伤代谢组学研究将亚急和亚慢毒性剂量的芫花生品和炮制品提取物分别灌胃给予大鼠,以血清生化和组织病理学结果作为依据,建立了基于超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)技术的大鼠尿液和血清的代谢组学方法,对内源性代谢物的变化进行研究。芫花生品组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平均显著高于正常对照组。组织病理学结果表明芫花生品组大鼠肝脏出现明显的病理改变,而芫花炮制品对大鼠生理状态有一定的负面影响,但未见明显的肝损伤。对大鼠尿液和血清样品的原始谱图进行主成分分析(PCA)。在尿液和血清的得分图(score图)上,正常对照组和芫花生品组均能得到很好的区分,炮制品组在score图上接近正常对照组,分布在远离芫花生品组的位置。从载荷图(loading图)中获得亚急和亚慢剂量下芫花致肝损伤尿液生物标记物,包括肌酐、牛磺酸、亮氨酸、2,8-二羟基喹啉、3-羟基-3-甲基吲哚、苯丙氨酸、马尿酸、犬尿喹啉酸、苯乙酰甘氨酸、黄尿烯酸、亮脯氨酸、泛酸、N2-琥珀酰-L-鸟氨酸、L-苯丙氨酰-L-羟脯氨酸、C18植物鞘氨醇和胆酸。血清生物标记物包括鞘氨醇和溶血卵磷脂。根据生物标记物的生理功能,推测芫花致肝损伤涉及的生物途经,对肝损伤发生机制进行了初步的阐释,并对炮制减毒机制进行了探讨。2.芫花致肝损伤作用部位的筛选和主要化学成分的质谱鉴定将芫花提取物的氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取物分别灌胃给予大鼠,以血清生化指标和组织病理学结果作为依据,采用上述基于UPLC-MS技术的大鼠尿液和血清的代谢组学方法,筛选芫花致肝损伤作用部位。芫花氯仿萃取物组大鼠的转氨酶水平显著高于正常对照组,且大鼠肝组织出现与灌胃给予芫花提取物相似的病理学改变。而其他各萃取物组大鼠的血清转氨酶水平与正常对照组无显著差异,且未见明显病理学改变。PCA得到的score图上,氯仿萃取物组与正常对照组的距离均大于其它萃取物组与正常对照组间的距离。从loading图中筛选出致肝损伤氯仿萃取物的尿液和血清生物标记物,与芫花提取物致大鼠肝损伤的生物标记物和所涉及的生物途经基本一致。结合血清生化和组织病理学结果,揭示芫花氯仿萃取物是芫花致肝损伤作用部位。应用高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用(HPLC-QTOF/MS)技术对芫花致肝损伤氯仿萃取物的主要化学成分进行了分离鉴定,确定了芫花氯仿萃取物中的42个色谱峰。结合各色谱峰的一级全扫描精确分子量信息和提取离子二级质谱扫描碎片信息,初步鉴定了 34个化合物的化学结构,其中瑞香烷二萜类化合物21个、黄酮类化合物6个、木脂素类化合物4个和其他类化合物3个,确定了芫花致肝损伤毒性物质基础,为进一步的芫花致肝损伤机理和炮制减毒机制研究奠定了基础。3.芫花致肝损伤作用部位炮制前后化学成分的变化研究建立了植物代谢组学方法,并应用于芫花致肝损伤氯仿萃取物在炮制前后化学成分变化的研究。PCA输出的score图上,芫花生品与炮制品能得到很好的区分,从相应的loading图中获得炮制后有显著变化的8个化合物,可以作为区分芫花生品和炮制品氯仿萃取物的化学标记物,鉴定了其中6个化合物的化学结构,分别为芫花素、羟基芫花素、芫花木内酯、Orthobenzoate 2、芫花烯和芫花酯甲。建立了同时测定羟基芫花素、芫花素、芫花烯和芫花酯甲的液相色谱-质谱联用(LC-MS)方法,并对4个成分在生品和炮制品致肝损伤氯仿萃取物中的含量进行测定。芫花生品氯仿萃取物中羟基芫花素、芫花素、芫花烯和芫花酯甲的含量分别为2096±594,3724±674,114.0±26.2和166.9±74.6μg·g-1,炮制品氯仿萃取物中的含量分别为2238±718,3919±822,98.2±23.3和139.5±63.0μg·g-1。炮制后,羟基芫花素和芫花素的含量显著升高,而芫花烯和芫花酯甲的含量显著降低。结果表明芫花烯和芫花酯甲可能是芫花致肝损伤毒性成分。4.芫花致肝损伤作用部位含药血清和芫花烯、芫花酯甲对HL-7702细胞毒性研究建立体外人正常肝细胞(HL-7702)培养模型,以黄药子为阳性对照药,以细胞酶水平、细胞生长形态和细胞生长抑制率为指标,对芫花生品和炮制品致肝损伤氯仿萃取物含药血清的体外肝细胞毒性进行研究。芫花生品组的细胞酶水平显著升高,肝细胞形态发生明显的病理性改变,而炮制品组细胞酶水平和细胞形态未发生明显的变化。芫花生品致肝损伤氯仿萃取物含药血清对HL-7702细胞24,48和72 h的最大增殖抑制率分别为27.21%,47.32%和61.88%。芫花炮制品致肝损伤氯仿萃取物含药血清对HL-7702细胞24,48和72 h的最大增殖抑制率分别为19.52%,26.20%和35.11%。应用已经建立的体外HL-7702细胞培养模型,以细胞酶水平、细胞生长形态和细胞生长抑制率为指标,以黄独乙素为阳性对照药,对芫花烯、芫花酯甲的体外肝细胞毒性进行研究。高剂量的芫花烯和中高剂量的芫花酯甲对人正常肝细胞的细胞酶水平和细胞形态有一定的影响。芫花烯对HL-7702细胞24,48和72 h的最大增殖抑制率分别为39.20%,56.13%和63.71%,半抑制浓度(IC50)值分别为177.5,112.5和45.82 μg·mL-1。芫花酯甲对HL-7702细胞24,48和72 h的最大增殖抑制率分别为69.24%,76.11%和84.4%,IC50值分别为48.52,15.24和10.35 μg·L-1。结果表明芫花生品致肝损伤氯仿萃取物含药血清和毒性成分芫花烯、芫花酯甲对HL-7702细胞具有细胞毒性作用,对芫花毒性机理的研究进行了探索。