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在世界范围内，食管癌的高发区包括：中国（21／10万人），南美（13／10万人），西欧（11／10万人），南非（10／10万人），日本（9／10万人）和前苏联地区（8／10万人）。从90年代以来，某些危险因素得到有效的干预和改善后，河南省食管癌发病率和死亡率呈缓慢下降趋势，但仍明显高于全国平均水平。因而，早诊早治以提高食管癌患者的五年生存率成为目前研究的重要课题。随着分子生物学的发展以及各种分子实验方法的完善和成熟，PCR、western blotting以及免疫组织化染色法等技术已比较成熟，从而为我们从分子水平研究食管癌提供了良好的条件。Eph激酶是受体酪氨酸激酶的最大亚家族，目前已明确有14种受体和8种配体，根据序列同源性和与配体Ephrins结合的特性，Eph受体可以分为EphA和EphB两类。Ephrin配体分为EphrinA和EphrinB两个亚型。研究表明EphrinA类配体主要与EphA受体作用，而主要与EphrinB结合的为EphB受体。现已发现：在许多人类组织肿瘤中，两类Eph受体的基因或蛋白表达水平增加。尤其是EphB4已报道在许多肿瘤组织中高表达，包括结肠癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肺癌脑胶质瘤胃癌以及头颈部肿瘤的鳞癌。但是EphB4和EphrinB2与食管癌的关系研究却很少。本课题用定量real-time PCR和免疫组化方法分析EphB4和EphrinB2两种基因在食管癌原发灶及匹配正常食管组织中的mRNA和蛋白水平及与临床病理参数关系，并且对食管癌患者进行术后随访，研究了EphB4和EphrinB2两种基因对患者预后的影响。材料与方法1．对象选择、组织样本的采集与患者临床病理资料的收集选取2002年至2005年在医院就医的食管癌患者（征得同意后）作为研究对象，采集手术后患者食管癌原发灶及其匹配的正常食管组织标本（经病理学鉴定）96对。标本离体后立即放入液氮中，后放在—80℃冰箱中冷冻保存。收集患者的性别，年龄，家族史，肿瘤的大小、病理分级、位置以及是否有淋巴结转移等临床方面资料，用于统计分析和研究。2．样本中EphB4和EphrinB2 mRNA水平的测定采用荧光定量PCR测定食管癌患者癌组织及癌旁正常组织中EphB4和EphrinB2两种基因mRNA的表达。通过测定样本中目的基因模板的Ct值即循环阈值来反映模板的含量。3．样本中EphB4和EphrinB2蛋白水平的测定通过免疫组织化学染色法测定96例食管癌患者癌组织及其癌旁正常组织中EphB4和EphrinB2蛋白表达水平，每一标本在200倍显微镜下观察3个染色最强的视野，记数阳性细胞数，并计算阳性细胞百分比，每个患者的食管癌组织中阳性细胞百分比与正常食管组织中阳性细胞百分比比值作为食管癌蛋白表达水平指标。4．生存分析2007年1月-2月期间，对2002年至2005年在医院就医并采集到标本的食管癌患者进行随访，患者手术治疗时刻作为生存的起始事件，随访时间结束作为终止时间，终点事件与起始事件之间的时间间隔定义为患者的生存时间。5．统计学分析运用SPSS12.0统计分析软件对数据进行分析，对每一个组织样本，用ΔCt(CtEphB4和EphrinB2-Ctβ-actin)值表示目的基因与内参基因β-actin间Ct的差值，Δ（ΔCt）值等于ΔCt（正常食管组织）—ΔCt（食管癌组织）。对Δ（ΔCt）采用独立样本t检验。不同临床参数如性别、年龄、家族史、肿瘤的大小、病理分级、位置以及是否有淋巴结转移等的食管癌样本的EphB4和EphrinB2基因mRNA的表达水平差异比较采用x2检验，不同临床参数食管癌样本中EphB4和EphrinB2蛋白表达水平差异比较采用t检验或方差分析，两种基因表达量之间的相关性采用Pearson’s相关分析。绘出每一种基因的表达阳性与阴性的患者Kaplan-Meier生存曲线，采用Log-rank（时序检验）来比较两条曲线的差异。采用Cox回归（比例危险率回归模型）分析临床参数与基因表达对生存的影响。以a=0.05作为检验水准。结果1实时荧光定量PCR结果1．1 EphB4和EphrinB2基因在食管癌组织中和匹配正常食管组织中的mRNA表达水平实时荧光定量PCR结果显示，在96例样品中，与匹配正常食管组织相比，EphB4和EphrinB2分别在77％（74／96）和61％（59／96）的食管癌组织中的表达上调。单因素分析表明，食管癌组织与匹配正常食管组织相比EphB4基因的mRNA的表达水平差异有统计学意义（t=6.411，P=0.000），而EphrinB2基因的mRNA的表达水平差异无统计学意义（t=1.375，P=0.172）。Pearson’s相关分析表明，在食管癌组织中，EphB4基因和EphrinB2基因的mRNA的表达呈现高度正相关（r=0.520，P=0.000）。1．2 EphB4和EphrinB2基因在食管癌组织中的表达与临床参数之间的关系EphB4在不同病理分级中表达有显著性差异（x2=6.294，P=0.043），有家族史组患者EphB4表达水平显著高于无家族史患者（x2=53.94，P=0.000），淋巴结转移组食管癌组织中的表达显著高于淋巴结未转移组（x2=11.039，P=0.001），食管下段的癌组织EphB4的表达显著高于上段癌组织表达水平（x2=9.167，P=0.010），肿瘤体积大的癌组织的EphB4表达水平显著高于肿瘤体积小的癌组织（x2=14.415，P=0.001）。有家族史的患者的癌组织EphrinB2表达水平显著高于无家族史患者的癌组织（x2=15.668，P=0.000），食管下段癌组织EphrinB2表达水平显著高于食管上段癌组织（x2=6.075，P=0.048）。2免疫组化结果2．1 EphB4和EphrinB2蛋白在食管癌组织中与正常食管组织中的表达配对t检验结果显示，EphB4和EphrinB2两种蛋白在食管癌组织中表达水平均显著高于其匹配正常食管癌组织（t=21.603，P=0.000；t=38.322，P=0.000），与real-time PCR结果相一致。2．2 EphB4和EphrinB2蛋白在食管癌组织中的表达与临床病理参数之间的关系对临床病理参数进行单因素分析，淋巴结转移组癌组织中EphB4和EphrinB2蛋白表达水平均显著高于淋巴结未转移组（t=2.862，P=0.005；t=2.987，P=0.004），有肿瘤家族史组EphB4蛋白表达水平显著高于无肿瘤家族史组（t=3.181，P=0.002），而EphrinB2蛋白表达水平在有肿瘤家族史与无肿瘤家族史组间无显著性差异（t=0.136，P=0.892）。不同肿瘤大小间EphB4和EphrinB2两种蛋白表达水平均存在显著性差异（F=13.129，P=0.000；F=4.174，P=0.018），肿瘤体积越大，食管癌组织中蛋白表达水平越高。不同病理级别间只有EphB4蛋白表达水平存在显著性差异（F=5.882，P=0.004），Ⅲ，Ⅱ级食管癌组织EphB4蛋白表达水平显著高于Ⅰ级食管癌组织（P=0.001，P=0.015），而不同病理级别间EphrinB2蛋白表达水平无显著性差异（F=0.82，P=0.443）。3．生存分析食管癌组织EphB4和EphrinB2高表达患者的平均生存时间显著低于EphB4和EphrinB2低表达的患者（P=0.000，P=0.019）。单变量生存分析表明，有家族史的患者的平均生存时间比无家族史的患者显著缩短（P=0.000），年龄较小的患者的平均生存时间比年龄较大的患者显著缩短（P=0.000）。此外，有淋巴结转移的患者的平均生存时间也显著低于无淋巴结转移的患者（P=0.009）。多因素生存分析（COX回归分析）表明，EphB4、EphrinB2和淋巴结转移与病人的生存时间相关，相对危险度分别是4.889（95％CI1.804～13.300），3.310（95％CI1.685～6.505）和2.000（95％CI1.046～3.822）。结论1．食管癌组织EphB4基因的mRNA表达水平显著高于其匹配正常食管组织，而EphrinB2基因在食管癌组织与其匹配正常食管组织中mRNA的表达水平差异无统计学意义。并且，食管癌组织中EphB4基因和EphrinB2基因的mRNA表达水平呈现高度正相关。EphB4在不同病理分级中表达有显著性差异，有家族史组患者EphB4表达水平显著高于无家族史患者，淋巴结转移组食管癌组织中的表达显著高于淋巴结未转移组，食管下段的癌组织EphB4的表达显著高于上段癌组织表达水平，肿瘤体积大的癌组织的EphB4表达水平显著高于肿瘤体积小的癌组织。有家族史的患者的癌组织EphrinB2表达水平显著高于无家族史患者的癌组织，食管下段癌组织EphrinB2表达水平显著高于食管上段癌组织。2．EphB4和EphrinB2两种蛋白在食管癌组织中表达水平均显著高于匹配正常食管癌组织。伴有淋巴结转移癌组织中EphB4和EphrinB2蛋白表达水平均显著高于不伴有淋巴结转移组织，有肿瘤家族史患者癌组织EphB4蛋白表达水平显著高于无肿瘤家族史患者癌组织，不同肿瘤大小间EphB4和EphrinB2两种蛋白表达水平均存在显著性差异，肿瘤体积越大，食管癌组织中蛋白表达水平越高。EphB4蛋白表达水平在不同病理级别间存在显著性差异，肿瘤分化程度越低，蛋白表达水平越高。3．食管癌组织EphB4和EphrinB2高表达患者的平均生存时间显著低于EphB4和EphrinB2低表达的患者。EphB4、EphrinB2和淋巴结转移是影响患者生存时间的独立危险因素。4．EphB4和EphrinB2在食管癌组织的表达高于正常食管组织，两种基因的高表达可能与食管癌的发生、发展及转移有着密切的关系，并影响着患者的预后。因此EphB4和EphrinB2可作为食管癌患者术后预后的一个评价指标，并可能成为基因治疗的一个作用靶点。