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为了进一步了解红树林沉积物中的微生物群落结构和功能,本论文以广东湛江以及福建漳江口红树林国家级自然保护区为研究区域,设置9个采样站位,对湿地沉积物样品的理化参数、细菌生物量及代谢活性(电子传递系统活性——ETSA)等进行了不同季节的跟踪调查;采用16S rRNA基因文库构建技术、限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)分型技术和变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术分析了红树林沉积物中的细菌群落结构及季节活动规律;以细菌多样性最高的站位样品作为驯化对象,从中筛选出一批废水处理功能菌(系)。主要的研究结果如下:
1)分别测定了第一季度湛江和云霄红树林沉积物的pH值、含盐量、含水率、总有机碳(TOC)、总氮(TN)、铵态氮和碳氮比(C:N)等理化参数,同时也测定了沉积物中的细菌生物量和电子传递系统活性,并对以上环境参数进行相关性分析,结果表明:不同站位间的环境参数存在差异;湛江和云霄沉积物的pH值变化范围分别为5.62~6.44和6.52~7.23;含盐量的变化范围分别是6.20~25.70mg/g和10.90~17.60mg/g;含水率的变化范围分别是4.49%~19.16%和37.37%~72.81%;总有机碳含量的变化范围分别是0.72%~5.07%和0.97%~2.07%;总氮含量的变化范围分别是0.05%~0.26%和0.10%0.14%;铵态氮的变化范围分别是0.03~5.60mg/kg和0.29~4.86mg/kg;碳氮比的变化范围分别为14.31~18.73和10.02~14.37;生物量的变化范围分别为18.67~44.88mgC/g和5.60~17.94mgC/g;电子传递系统活性的变化范围分别为0.23~1.47和3.13~6.60μgO2/g/h;湛江与云霄红树林沉积物中的ETSA值与含水率成极显著正相关,相关系数均为0.992;湛江红树林沉积物中的ETSA值与pH值成极显著负相关,相关系数为0.978,而云霄沉积物中的ETSA值与pH值无显著相关性;两地沉积物中的生物量与沉积物各理化参数均无显著相关性;
2)采用基因指纹技术(DGGE),对红树林不同季节不同站位沉积物中的细菌群落结构的变化规律进行分析。结果表明:红树林各站位沉积物样品的细菌群落结构受季节影响,湛江第二季度样品的细菌多样性最高,物种平均数(S)的范围为30.5~42;而云霄第三季度样品的细菌多样性最高,物种平均数(S)的范围为31.2~39。红树林各站位沉积物样品的细菌群落结构受植被类型影响,红树林区沉积物中的微生物多样性高于非红树林区的微生物多样性;聚类分析结果表明红树林各站位沉积物样品的细菌群落结构受地理位置影响,同一区域相邻站位相似性系数较高,分类位置较接近。
3)对第二季度红树林沉积物DGGE图谱中的30条优势条带进行测序分析,结果表明:沉积物中的优势细菌分属于8个门(Proteobacteria(40%)、Firmicutes(20%)、Actinobacteria(16.67%)、Deferribacteres(6.67%)、Bacteroidetes(6.67%)、Aquificae(3.33%)、Chloroflexi(3.33%)、Spirochaetes(3.33%));占绝对优势的Proteobacteria中,有50%归属于a-proteobacteria类群,25%归属于γ-proteobacteria类群,另外25%归属于δ-proteobacteria类群;
4)采用16S rRNA基因文库构建技术,对9种不同植被下沉积物中的细菌多样性进行分析,共获得9个文库1225条有效序列(湛江4个文库589条有效序列,云霄5个文库636条有效序列),平均每个文库有效序列达136条。所有序列的比对分析结果表明:红树林沉积物具有很高的细菌多样性,文库中涵盖了21个门类的细菌,其中Proteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Planctobacteria、Verrucomicrobia6个门类的细菌为各个站位文库所共有,且各文库中最优势菌群均为Proteobacteria,所占比例均超过50%,同时γ-proteobacteria和δ-proteobacteria在Proteobacteria类群中均占主导地位;一些特殊的细菌类群仅在特定的站位中出现,如Deinococcus-Thermus类群仅出现在木榄生境的沉积物中,Tenericutes类群仅出现在桐花树生境的沉积物中。从系统进化关系分析可知,文库中约有17%的克隆子序列归属于Unclassify类群,这就意味着红树林中蕴藏着很多尚未挖掘出来的菌种资源;约有2%的克隆子序列与Deferribacteres类群分枝相邻,而该类群菌能够利用多种电子受体,推断这类菌群与红树林沉积物具有的高还原力特点相关;系统发育树的δ、γ和ε-proteobacteria类群分枝中,附属有大量与N、S代谢有关的序列,可以推测这些序列所代表的菌群在红树林湿地的N、S循环中起着不可或缺的作用;同时还发现文库中有很多序列与活性污泥中的主要功能菌(如Pseudomonas、Flavobacterium、Nocardia Alcaligenes、Arthrobacter、Micrococcus、Bacillus)相似,可以推断这些菌与红树林具有的净化海区环境功能密不可分,同时也意味着红树林沉积物中蕴藏着大量与废水处理功能相关的菌种资源。
5)采用逐步驯化、定向富集的手段筛选分离得到27株废水处理功能菌,经16S rRNA基因测序可知:其中有2株归属于Achromobacter,2株归属于Acidovorax,5株归属于Alteromonas,4株归属于Arthrobacter,1株归属于Microbacterium,5株归属于Bacillus,2株归属于Ochrobactrum,2株归属于Pseudomonas,4株归属于Rhodococcus;从系统进化关系分析可知,有11株菌与常见的异养硝化-好氧反硝化菌进化地位相接近,推断这类菌很可能兼具有硝化和反硝化功能。在测定COD去除率时发现,除菌HX10无去除效果外,其余菌对COD均有一定的去除作用,去除率最高可达97%,最低的仅为4%;各菌对氨氮均具有一定的去除效果,但是去除率不高,均低于50%。其中去除率最高达41.25%,最低仅为2.43%。