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背景:Dnd1基因在小鼠雄性生殖细胞发生和睾丸生殖细胞瘤发生中有重要作用,但其作用机制及其与人类疾病关系仍未明了。在前期工作中,我们已通过酵母双杂交技术筛选到四个与人DND1相互作用的蛋白,它们分别是GRN、FLAD1、RNF31、EFEMP1。其中Grn基因在调节细胞生长、损伤修复和肿瘤的发生中起重要作用。由于酵母双杂交系统的筛选存在假阳性结果,为此我们利用免疫共沉淀、GST pull-down及细胞内共定位的方法验证DND1与GRN的相互作用。我们可通过验证Grn和Dnd1的相互作用,来找出它们之间的联系,为进一步阐明Dnd1的生物学功能奠定基础。实验目的:验证DND1与GRN的相互作用。实验方法:(1)用PCR的方法扩增Dnd1片段,通过酶切与连接,将Dnd1片段构建到原核表达载体pET32a和真核表达载体pCDNA3.1-myc-his,pemRFP-C1上,再转化入感受态细胞TOP10,菌液PCR鉴定阳性克隆并测序分析;(2)从人单核细胞系THP-1细胞cDNA中扩增出Grn片段,通过酶切与连接,将Grn片段构建到原核表达载体pGEX-4T-2和真核表达载体pemGFP-C1上,再转化入感受态细胞TOP10,菌液PCR鉴定阳性克隆并测序分析;(3)通过细胞内共定位的方法,确定GRN与DND1在细胞内相互作用的亚细胞位置;(4)利用免疫共沉淀技术,验证DND1与GRN真核表达产物细胞内是否具有相互作用;(5)利用GST pull-down技术,验证GRN与DND1原核表达产物细胞外是否具有相互作用。实验结果:(1)成功构建人Dnd1原核表达和真核表达的重组载体:pET32a-dnd1,pCDNA3.1-myc-his-dnd1和pemRFP-C1-dnd1;(2)成功构建人Grn原核表达和真核表达的重组载体:pGEX-4T-2-grn和pemGFP-C1-grn;(3)细胞内共定位实验结果表明GRN与DND1在细胞质中有明显的共定位;(4)免疫共沉淀试验证实DND1与GRN在真核细胞内具有相互作用;(5)GST pull-down试验结果表明DND1与GRN在体外具有相互作用。实验结论:利用细胞内共定位实验、免疫共沉淀和GST pull-down试验证实GRN与DND1具有相互作用,为继续深入研究Dnd1基因信号传导通路及其生物学功能奠定基础。