论文部分内容阅读
Gpr161蛋白是一种G蛋白偶联受体（G Protein Coupled Receptor,GPCR）[9]。GPCR均是含有7个跨膜结构域的蛋白受体,是参与细胞信号传导的最大的细胞表面分子家族,参与调控多种不同的细胞功能,GPCR是目前各种疾病临床治疗的主要药物靶点[15]。小鼠的研究提示,Gpr161在脊椎动物Hedgehog（Hh）信号通路中发挥重要的作用,Gpr161的缺失会导致小鼠胚胎致死。组织特异性敲除Gpr161导致小鼠出现多并趾、大脑发育不良和头骨闭合不全等畸形。研究人员发现GPR161是Hh通路的负向调控因子,通过调节细胞内cAMP的水平调控Hh通路下游的信号转导[20]。然而,Gpr161在动物发育早期和Hh通路中功能在进化上是否具有保守性并不明确。特别是在人Hh通路相关癌症——髓母细胞瘤大规模测序中并没有发现Gpr161的突变与癌症的发生有关。此外,临床研究中仅有一例关于GPR161缺失后导致患者垂体柄发育异常的报道[26]。这些结果使得在其它模式动物中对于GPR161功能的研究显得格外的重要。为了深入探索GPR161在脊椎动物早期发育和Hh通路中的功能,本研究以斑马鱼为模式动物,对Gpr161进行了克隆和研究,具体内容如下:1.我们通过生物信息学分析,克隆获得了斑马鱼两个gpr161同源基因,分别命名为gpr161a和gpr161b;通过全胚胎原位杂交技术（Whole mount in situ hybridization,WISH）以及实时定量PCR（qRT-PCR）分析了这两个基因的转录情况,发现它们在胚胎发育时期均存在遍在表达[10]。但是gpr161a在神经管和近轴细胞（adaxial cell）中有富集,而gpr161b在神经管的中轴附近富集,提示其功能并不完全冗余,可能存在差异。2.为了进一步研究Gpr161在斑马鱼胚胎发育中的功能,我们应用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建了斑马鱼gpr161基因的缺失突变体。初步表型分析显示,无论是gpr161a-/-和gpr161b-/-单突变纯合子还是gpr161a-/-与gpr161b-/-双纯合突变体,均可以正常发育,没有出现明显的异常表型。这一结果与小鼠Gpr161缺失突变体不一致。提示Gpr161在脊椎动物中的功能可能并不保守,或者斑马鱼在进化中获得了其他的补偿效应以应对gpr161缺失的效应。3.为了进一步研究Gpr161在Hh信号通路的功能是否保守。我们对斑马鱼gpr161突变体的Hh信号通路的活性进行了干预和分析。通过Hh通路特异性的分子标记ptch2,olig2与nkx2.2a的表达情况,以及慢肌纤维的分化情况对gpr161缺失突变体对不同信号活性干预的应答情况进行了分析,初步的结果显示gpr161缺失突变体本身并没有表现出Hh活性的异常,而且在上调和下调Hh活性的干预下,gpr161突变体与野生型也没有明显的差异,提示Gpr161可能不是斑马鱼Hh通路重要的调控因子,而Gpr161在Hh通路中的功能并不保守。综上所述,本研究基于斑马鱼动物模型,克隆了gpr161同源基因,分析了其表达情况;建立了斑马鱼gpr161缺失突变体模型,并对其表型进行了初步的分析;同时对于缺失突变体Hh通路活性进行了初步的分析,为深入研究gpr161基因的功能提供了重要的实验材料和前期数据的积累,为进一步研究脊椎动物Hh通路的分子机制提供了重要的证据和线索。