亚油酸异构酶基因的克隆、表达及其功能鉴定

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共轭亚油酸(conjugatedlinoleicacid,CLA)是亚油酸(linoleicacid,LA)具有共轭双键的所有位置和几何异构体的统称。其中,9-cis,11-trans-CLA和10-trans,12-cis-CLA等异构体具有抗癌等重要生理功能。目前,CLA的工业化制备主要是化学法生产,产物是CLA多种异构体的混合物,这不利于其在食品和医药方面的广泛应用。自然界中一些细菌具有将LA转化为CLA的能力,细菌体内酶的作用具有更高的专一性和转化效率,有很好的应用前景。 本论文从一株高产CLA的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)lp-18出发,通过比对分析已知的细菌体内亚油酸异构酶的序列,利用PCR和IPCR技术,得到L.plantarumlp-18基因组中2116bp的DNA片段,含有一个完整的ORF,即为推定的亚油酸异构酶基因(pli18)。pli18序列全长1710bp。 将pli18基因克隆入pET30a原核表达载体中,转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)重组表达。经过优化表达条件,在含1%葡萄糖LB培养基中培养,18℃,0.1mMIPTG诱导,摇床培养20h实现重组蛋白PLI18最优化表达。通过Ni离子亲和层析一步纯化得到PLI18纯酶。PLI18分子量约68kDa。 使用纯化的PLI18进行了酶活鉴定实验,纯酶比活达到285U/mg.对酶活反应产物进行萃取、甲酯化和气相色谱检测,结果证实PLI18将LA底物转化为9-cis,11-trans-CLA,表明重组蛋白具有亚油酸异构酶活性,从而证明pli18确定为一个新的亚油酸异构酶基因,该酶和已知的亚油酸异构酶一样都是肌球蛋白交叉反应抗原类家族蛋白,但氨基酸序列相似性低于30%。
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