多发性硬化(multiple sclerosis, MS)是一种在青少年时期发病的中枢神经系统(central nervous system, CNS)脱髓鞘疾病,特点是病灶多发,发病率可高达0.05-0.1‰,最多发的年龄在20-40岁之间,30岁为发病高峰。多数病人每次发作后遗留一定后遗症,随发作次数增多,后遗症逐渐加重。典型的病例为缓解-复发,阶梯式恶化。MS的病因不确定,主要病理变化表现为脊髓、脑干、小脑与大脑白质中可见多发性脱髓鞘病灶。在脱髓鞘性胶质硬化斑中可见少突胶质前体细胞(Oligodendrocytes precursor cells, Opcs)的募集减少或者有大量Opcs集聚,但是未分化成少突胶质细胞(Oligodendrocytes, OL)。因此,对MS的针对性治疗是:脱髓鞘轴突的髓鞘再生。目前对于MS尚无针对性治疗药物。促肾上腺皮质激素和皮质激素有利于缩短急性发作期,但不影响病程和长期预后。对皮质激素疗效不佳和重度副反应者可以采用免疫抑制剂,但对整个病程没有明显影响。另有其它多种疗法,如血浆置换、抗淋巴细胞血清、转移因子、干扰素、IgG制剂等,但疗效不确定,有待定论。所有这些治疗方法,均存在疗效不肯定、副作用大、费用高、对MS的远期治疗效果不佳等问题。研究发现,对乙啡啶溴化物注射所致的CNS脱髓鞘模型进行孕酮干预,成年大鼠的脱髓鞘轴突的比例明显减少,OL参与的髓鞘再生明显增加。孕酮明显增加老年雌性大鼠小脑脚髓鞘再生轴突的比例。孕酮可以减少脑外伤后的神经症状;促进老年公鼠CNS髓鞘再生的速度加快,修复率增加;促进体外培养的Opcs分化成OL,加快体外培养的小脑模型髓鞘形成。虽然孕酮对CNS髓鞘再生作用的机制还不清楚,但是苏格兰已经于2005开始进行大规模的POPART’MUS(Prevention of Post Partum Relapses With Progestin and Estradiol in Multiple Sclerosis)临床研究,对产后的MS患者立即给予大剂量的孕酮治疗,观察孕酮对MS产后复发的预防效果和治疗效果,该研究预计2008年结束。DNA结合抑制因子( inhibitor of DNA binding,Id )为碱性螺旋-环-螺旋(basichelix-loop-helix,bHLH)转录抑制因子,含有HLH结构域。与bHLH蛋白不同,Id蛋白缺乏结合DNA的碱性区域。最初的研究发现,Id蛋白在处于分裂期的肌肉前体细胞中合成,可调控多种细胞的分化、发育,对多数细胞分化起抑制作用,在细胞分化的过程中该基因表达下降。Id2蛋白广泛参与T细胞发育、肿瘤增殖、细胞周期调控以及肌肉发生等生物学功能。近年来,发现其在神经系统中也有重要作用,从Id2基因敲除的小鼠中发现,神经系统发生异常,成神经细胞不能成熟分化。原位杂交研究发现,Id2在室管膜区神经前体细胞中以及在周围神经系统中的背根神经节感觉神经前体细胞中有表达,说明Id2与神经系统的分化发育有密切关系。脊髓损伤后中央管周围Nestin阳性细胞同时也表达Id2 mRNA,表明Id2在神经祖细胞中也有表达,而这种祖细胞具有多分化潜能,提示Id2在神经系统损伤及修复中可能发挥重要作用。研究表明,孕酮可以促进OL细胞系的发育,使与OL成熟相关的基因表达增强,这些基因的募集是Opcs更快分化成OL的基础,从而使髓鞘再生的速度加快。而少突胶质前体细胞向少突胶质细胞分化起始Id2由胞核转移到胞质。过表达Id2几乎可完全阻滞少突胶质前体细胞向少突胶质细胞分化,Id2 -/-少突胶质前体细胞不能分化为成熟的少突胶质细胞,表明Id2在少突胶质细胞分化中起重要作用。那么孕酮的作用机制是否通过调节Id2表达的变化从而影响少突胶质细胞的分化,进而促进CNS髓鞘再生,是本实验需要观察和研究的。实验性变态反应性脑脊髓炎模型(experimental allergic encephalomyelitis , EAE)是研究多发性硬化的理想动物模型。因此,本研究运用免疫组织化学以及荧光双标技术,检测了Id2在正常成年大鼠脊髓中的表达,以及Id2在EAE模型不同时间点的表达变化规律,并初步探讨了Id2在经孕酮治疗EAE模型不同时间点表达变化,主要得到以下结果:1.Id2在正常大鼠脊髓中的表达免疫组织化学显示Id2阳性细胞在正常成年大鼠脊髓颈、胸、腰、骶段灰质各板层及白质均有分布,胞质、胞核均可着色。DAB显色免疫阳性反应为棕黄色。1.1灰质:各节段分布无明显差异。在Ⅰ-Ⅲ板层Id2主要位于胞核,染色较深。且从Ⅰ-Ⅲ层,数目逐渐增多,少见胞质染色。在Ⅳ板层出现胞质淡染的阳性细胞且细胞体积较小,同时可见胞核染色阳性颗粒。在Ⅴ板层和Ⅶ板层出现胞质染色的单级和双级细胞,数目较Ⅳ板层明显增多,细胞体积较Ⅳ板层明显增大,在Ⅶ板层还可见串珠样排列阳性细胞,此层仍可见较多胞核染色阳性颗粒。Ⅷ板层阳性细胞形态与Ⅶ板层相似,但胞质染色阳性细胞体积较Ⅶ板层大,染色也较Ⅶ板层深,也可见较多胞核深染颗粒。在Ⅸ板层主要为胞核深染的颗粒,少见胞质染色的细胞。在灰质中间内侧细胞柱及中间外侧细胞柱Id2胞质、胞核均有表达,且胞核深染胞质淡染。1.2白质: Id2在白质的胶质细胞和神经纤维中广泛分布,脊髓外侧核(Lateral spinal nucleus,Lsp)及锥体束(Pyramidal tract,PY)可见深染阳性颗粒。1.3荧光双标结果: GFAP阳性星形胶质细胞在脊髓分布广泛,灰质及白质均可见阳性细胞。高倍镜下可见伸出较多的突起且突起长度较长。CC-1阳性少突胶质细胞在脊髓也可见较多分布,主要表达于胞质、胞体小,突起短。同一切片分别与CC-1、GFAP、β-tubulin双标表明Id2在脊髓与CC-1标记的少突胶质细胞有共表达。GFAP阳性星形胶质细胞与Id2在脊髓不共表达。β-tubulin阳性神经元与Id2在脊髓不共表达。2.Id2在大鼠EAE模型不同时间点脊髓的分布大鼠EAE模型发病不同时间点Id2在脊髓颈、胸、腰、骶段灰质及白质均有分布,主要表达于细胞核内,也可见胞质表达。EAE模型发病不同时间点Id2表达与正常对照组、佐剂对照组比较均有显著性差异(P<0.01),正常对照组与佐剂组无统计学差异(P>0.05)。脊髓Id2表达积分光密度值在正常大鼠脊髓表达较低,EAE模型发病不同时间点Id2表达均较正常组及佐剂对照组升高(P<0.01)。在发病第6天Id2表达最强,达到最大值,此后表达逐渐降低,第8天时表达最低。为最小值。8天后表达逐渐增加,第10、15天时仍可见较高水平的表达。荧光双标结果显示在EAE模型不同时间点,CC-1标记的少突胶质细胞也表达Id2,表明在EAE模型脊髓少突胶质细胞表达Id2。3.Id2在孕酮治疗的不同时间点脊髓的分布Id2在经孕酮治疗第6、8、10、15天EAE大鼠模型脊髓颈、胸、腰、骶段灰质各板层及白质均有分布,主要表达于细胞核内,与正常组相比Id2在胞质表达明显减少。经孕酮治疗第6天Id2在脊髓表达较高,第8天显著下降,第10、15天Id2表达逐渐上升。孕酮治疗前后Id2表达规律的统计结果: Id2在EAE模型脊髓的表达高于正常大鼠,经孕酮治疗6、8、10、15天Id2表达均较发病组显著降低(P<0.05)但仍高于正常组。在治疗第6天Id2表达降低最多(P<0.01),第15天降低最少,但与EAE模型组比较仍然有显著性差异(P<0.05)。结论:1.从蛋白水平应用荧光双标及酶标法观察了Id2在正常成年大鼠脊髓不同节段灰质各板层及白质的分布特点。这种分布特点及双标结果提示Id2可能与神经系统中构成髓鞘的少突胶质细胞损伤及修复相关。2.Id2在EAE模型发病不同时间点大鼠脊髓的表达变化的规律与EAE模型具有复发—缓解阶梯性恶化的特点一致。提示多发性硬化的发病与Id2密切相关。3.经孕酮治疗后EAE模型中Id2表达降低,提示孕酮对多发性硬化的治疗作用可能与影响Id2的表达有关。4.Id2主要表达在少突胶质细胞,表明Id2与构成髓鞘少突胶质细胞的发育分化密切相关。