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论文对本实验室鉴定的DPV UL29基因(GenBank登录号EF643566)开展了以下系列研究:DPV UL29基因序列生物信息学分析、克隆、原核表达、抗体制备及在DPV感染鸭胚成纤维细胞中表达产物的细胞定位和转录表达时相分析。所得实验结果如下:1.DPV UL29基因序列的生物信息学分析DPV UL29基因大小为3565 bp,编码1196 aa。NCBI的ORF Finder工具分析获得了在6个读框中不同的ORF的位置和长度,并采用NCBI的BLASTP工具对各个ORF进行逐一分析,发现其中一个3585bp大小的ORF能在GenBank中找到同源性较高的疱疹病毒UL29基因相关序列。DPVUL29基因与α疱疹病毒的同源性较高,氨基酸序列同源性为44%～53.6%,与β疱疹病毒和γ疱疹病毒同源性较低。2.UL29基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备通过构建pET32-UL29重组原核表达载体,利用IPTG进行诱导表达,得到大小约为148 kDa的重组融合蛋白,与预期表达的蛋白大小相一致,主要以包涵体的形式存在。最佳表达优化条件为0.2 mmol/L的IPTG,23℃下诱导3～4 h。利用纯化的重组蛋白制备兔抗高免血清,琼脂糖扩散试验效价为1∶16。兔抗UL29 IgG经正辛酸-硫酸铵盐析和High-Q阴离子交换层析纯化具有高效、特异性强的优点。3.DPV UL29基因产物在鸭胚成纤维细胞中的细胞定位分析通过免疫荧光进行病毒感染DEF细胞定位的检测,DPV UL29基因表达产物在DEF中的细胞定位是一个动态的变化过程,8 h在细胞核前体复制区,24 h到36 h转移到细胞核,48 h开始由向细胞质中分散,随后分散于细胞核与细胞质中,54 h分散在整个细胞中,这种动态的变化可能是由于UL29蛋白质合成场所和功能发挥场所发生转移,推测UL29蛋白在细胞核前体复制区完成蛋白质的合成,然后转移至细胞核内发挥其基本生物学功能,协助病毒DNA复制的起始、合成,以及对晚期蛋白表达和毒力调节具有重要作用。4.DPV UL29基因产物在鸭胚成纤维细胞中的转录和表达时相分析FQ-PCR结果表明,最早可在感染后1 h检测到该基因转录产物,随后转录产物量逐渐增大,24 h达高峰,一直持续到了感染后72 h。这种转录谱具有疱疹病毒早期基因的典型特征。以制备的兔抗UL29 IgG为一抗,对感染鸭瘟强毒的DEF进行Western-Blot分析,感染后4～54 h可检测到观察到与预测大小(约128 kDa)相一致的单一条带,以感染后12～24 h反应条带浓度最大,并一直持续到感染后期。综合分析DPV UL29基因的转录表达时相模式,推测该基因为病毒的早期基因,UL29的出现及其表达时相可能对晚期蛋白如衣壳蛋白、囊膜糖蛋白等的表达起激活作用,并与病毒的生长周期密切相关。