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麦穗鱼(Pseudorasbora parva)隶属于鲤形目(Cypriniformes),鲤科(Cyprinidae),麦穗鱼属(Pseudorasbora),为江河、湖泊、池塘等水体中常见的小型鱼类。缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor)是存在于各种动物和人体内的一种重要转录因子,可介导机体为适应低氧条件而发生的一系列反应。麦穗鱼能在极低氧环境下生存,对研究其 HIF-1α的基因调控具有重要作用。 本论文以麦穗鱼为研究村料,研究内容主要分为4部分: 第1部分:通过 RT-PCR及RACE技术从麦穗鱼体内克隆获得 HIF-1α基因的cDNA序列,井对其核苷酸和编码的蛋白序列进行了生物信息学分析。 第2部分:以管家基因-actin作为内参分于,利用RT-qPCR方法对不同温度(18℃,8℃)条件下低氧(浓度)处理后麦穗鱼鳃中HIF-1α基因的mRNA表达水平进行了定量研究。 第3部分:对麦穗鱼 HIF-1α基因进行了原核表达,井以纯化后的HIF-1α重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备了抗血清。 第4部分:以GAPDH为内参分于,通过 Western blot技术分析了8℃条件下低氧处理不同时间 HIF-1α蛋白的表达情况。 研究结果如下: (1)麦穗鱼 HIF-1α基因 cDNA序列全长3753 bp,包含一个长度为2325 bp的开放式阅读框(open reading frame, ORF),编码774个氨基酸残基,3端非编码区(3-UTR)长1224 bp,5端非编码区(5-UTR)长204 bp,推导的蛋白理论分于量为85.83 kD。同源性分析表明该基因与草鱼 Ctenopharyngodon idella的核苷酸序列相似性高达92%,蛋白序列间的相似性达97.8%。将该序列提交 GenBank,获得序列号为FJ794604。 (2)RT-qPCR结果表明,水温为8℃时,麦穗鱼鳃中HIF-1α基因在低氧刺激6 h时表达量最高,且与对照组具有显著性差异,24 h后恢复到对照组水平,48 h时表达量不变;水温为18℃时,低氧处理没有导致麦穗鱼鳃中HIF-1α基因表达的明显变化。 (3)利用原核表达系统成功实现了HIF-1α基因的重组表达。利用Ni柱进行亲和层析纯化得到目的蛋白,以纯化后的目的蛋白免疫新西兰大白兔制备 HIF-1α抗血清,最后 Western Blot结果表明此抗血清具有很好的特异性。 (4)Western blot实验结果表明,HIF-1α蛋白在缺氧6 h表达量明显升高,24 h表达量下降,但仍明显高于对照组,48 h后表达量进一步下降且低于对照水平。